Preparação da cepa estudada

2021-11-18 11:56:23 By : Ms. Li Chen

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Desenvolvimento e caracterização de hidrogéis carregados com nanopartículas de PLGA para administração ocular sustentada de norfloxacina no tratamento de ceratite por pseudomonas: um estudo experimental

Autores Gebreel RM, Edris NA, Elmofty HM, Tadros MI, El-Nabarawi MA, Hassan DH 

Publicado em 5 de fevereiro de 2021, Volume 2021: 15 páginas 399—418

DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S293127

Revisão por revisão por pares anônima única

Editor que aprovou a publicação: Dr. Anastasio Lymperopoulos

Rana M Gebreel, 1 Noha A Edris, 2 Hala M Elmofty, 2 Mina I Tadros, 3,4 Mohamed A El-Nabarawi, 3 Doaa H Hassan1 1Departamento de Farmacêutica, Faculdade de Ciências Farmacêuticas e Fabricação de Medicamentos, Universidade de Misr para Ciência e Tecnologia , Gizé, Egito; 2Departamento de Oftalmologia, Faculdade de Medicina, Universidade do Cairo, Cairo, Egito; 3Department of Pharmaceutics and Industrial Pharmacy, Faculty of Pharmacy, Cairo University, Cairo, Egypt; 4Departamento de Farmacêutica, Faculdade de Farmácia e Tecnologia de Medicamentos, Egyptian Chinese University, Cairo, Egypt Correspondência: Mina I Tadros Tel 20 1223620458 Fax 20 223628246 Email [email protected] Objectivo: Norfloxacin (NFX) tem baixa biodisponibilidade ocular. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver hidrogéis carregados com nanopartículas (NP) carregados com NFX para melhorar o potencial ocular de NFX, minimizar a necessidade de instilações frequentes e diminuir os efeitos colaterais indesejáveis. Métodos: NPs carregados com NFX foram desenvolvidos por meio da técnica de emulsão dupla / evaporação de solvente, de acordo com o planejamento fatorial completo 21.41, usando dois tipos de polímero de ácido polilático-co-glicólico (PLGA) e quatro razões (fármaco: polímero). NPs foram avaliados para tamanho de partícula (PS), índice de polidispersidade (PDI), potencial zeta (ZP), porcentagem de eficiência de aprisionamento de drogas (EE%), porcentagem de droga liberada após 30 min (Q30min) e 12 horas (Q12h), porcentagem de droga permeada através das córneas de cabra após 30 min (P30min) e 12 horas (P12h) e morfologia. Duas fórmulas foram selecionadas estatisticamente e incorporadas em hidrogéis à base de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC); G1 - G4. Os últimos sistemas foram avaliados quanto à aparência, clareza, pH, espalhabilidade, reologia, porcentagens de drogas liberadas, porcentagens de drogas permeadas, atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa e alterações histopatológicas. Resultados: Os NPs selecionados (NP2 e NP6) eram esféricos em forma e possuíam PS adequado (392,02 nm e 190,51 nm) e PDI (0,17 e 0,18), alta magnitude de ZP (−30,43 mV e - 33,62 mV), alto EE% (79,24% e 91,72%), baixo Q30min (10,96% e 16,65%) e P30min (17,39% e 21,05%) e promissores Q12h (58,23% e 71,20%) e P12h (53,31% e 65,01%), respectivamente. Foram desenvolvidos hidrogéis à base de HPMC límpidos, espalhados, toleráveis, pseudoplásticos e tixotrópicos. Eles mostraram liberação de drogas e perfis de permeação de drogas mais prolongados. Os hidrogéis carregados com NP2 e NP6 (sistemas G3 e G4, respectivamente) apresentaram atividade antibacteriana promissora e segurança histopatológica razoável. Conclusão: G3 e G4 são potenciais sistemas de liberação ocular para NFX. Palavras-chave: norfloxacino, nanopartículas, PLGA, entrega ocular, ceratite por Pseudomonas

A baixa biodisponibilidade oftálmica de medicamentos (˂1%) de colírios comuns ocorre principalmente devido aos fatores de perda pré-córnea, como o rápido turnover das lágrimas, a absorção não produtiva do medicamento, o tempo de residência momentâneo no fundo de saco e os pobres permeabilidade do fármaco à membrana epitelial da córnea.1,2 A biodisponibilidade ocular limitada dos fármacos favorece a necessidade de instilação frequente para atingir o efeito terapêutico direcionado, o que pode levar a efeitos colaterais indesejáveis ​​como resultado da absorção sistêmica do fármaco. A eficiência de um sistema de distribuição oftálmica de drogas depende da biodisponibilidade da droga, que pode ser aumentada estendendo o tempo de residência da droga pré-córnea e aumentando a penetração da droga na córnea.

A ceratite é uma doença ocular que pode resultar de infecção microbiana (por exemplo, bactérias, fungos, vírus ou protozoários) ou de danos não infecciosos, como causados ​​por trauma ocular ou exposição a produtos químicos ou luz ultravioleta. A ceratite microbiana é considerada uma infecção com risco de visão que pode causar ulceração da córnea e produzir cicatrizes, neovascularização e perda de visão em casos graves.4 A baixa adesão do paciente é geralmente encontrada com ceratite microbiana, uma vez que um cronograma de instilação frequente a cada 2-4 horas é necessário para infecções comuns e a cada 30 minutos para úlceras corneanas extremas. Após a instilação ocular, a solução ou suspensão do fármaco se mistura com o líquido lacrimal e permanece em contato com a mucosa por 1–2 minutos apenas devido à liberação contínua do líquido lacrimal. Além disso, a drenagem através do canalículo superior e inferior para o saco lacrimal e, em seguida, o ducto nasolacrimal induziria uma perda rápida do medicamento durante o piscar.5,6 A biodisponibilidade ocular do medicamento poderia ser aumentada pela alteração das características físico-químicas do medicamento e / ou o desenvolvimento de sistemas de entrega nano específicos.

A ceratite bacteriana é comumente causada por Pseudomonas aeruginosa, bactéria Gram-negativa em forma de bastonete, especialmente entre usuários de lentes de contato. Esta doença rapidamente progressiva e pode terminar em perda permanente de visão, se não for tratada adequadamente.7 As fluoroquinolonas suplantaram outros antibióticos como padrões de ouro para o tratamento de ceratite bacteriana por muitas razões, incluindo, as atividades bactericidas de amplo espectro, as melhores concentrações de drogas intraoculares, bem como os efeitos colaterais mais baixos e o potencial de resistência a drogas.8 Eles agem visando as enzimas bacterianas necessárias para a síntese de DNA, incluindo replicação, transcrição, reparo e recombinação.9 Norfloxacina (NFX) é um antibiótico fluoroquinolona sintético que é ativo contra Gram-positivos e Bactéria Gram-negativa.10 Infelizmente, NFX sofre de baixa biodisponibilidade ocular, possivelmente devido à sua limitada solubilidade aquosa e à extensa drenagem pré-córnea de drogas.11,12 Para ceratite, deve ser instilado (0,3%; 1-2 gotas) quatro vezes diariamente, até sete dias para manter uma concentração terapêutica eficaz do fármaco.

Nanopartículas (NPs) representam transportadores oculares promissores de drogas, uma vez que a maioria deles pode ser desenvolvida em condições moderadas para incorporar vários compostos bioativos. Em comparação com as preparações oculares tradicionais, os NPs mostram características de absorção de drogas notavelmente aprimoradas e taxas de eliminação de drogas mais lentas. Em uma linha paralela, são mais bem tolerados pelos pacientes do que micropartículas maiores.13

Poli (dl-lactídeo-coglicolídeo) (PLGA) representa uma ampla série de copolímeros biodegradáveis ​​e biocompatíveis que possuem grupos terminais livres de ácido carboxílico ou éster (lauril- ou metil éster-). O desenvolvimento de NPs de PLGA relativamente uniformes e facilmente redispersos requer a incorporação de um estabilizador como o álcool polivinílico (PVA) .15

Paralelamente a outros NPs mucoadesivos, os NPs PLGA são comumente usados ​​para alcançar sistemas de entrega sustentada de drogas promissores devido às suas características favoráveis, incluindo, cinética de degradação prolongada, facilitar o metabolismo de monômeros PLGA através do ciclo de Krebs no corpo, 16 e sua capacidade de contornar P- o efluxo de gp e, portanto, aumenta a permeação da droga na córnea.17 Além disso, os perfis de liberação da droga desejados e o esquema de dosagem subsequente podem ser facilmente ajustados. Copolímeros de PLGA, possuindo uma proporção de lactídeo: coglicólido de 50:50, foram investigados neste trabalho devido às suas características hidrofílicas e lipofílicas balanceadas e taxas promissoras.18 A encapsulação de agentes antibacterianos em NPs de PLGA foi investigada para aumentar a eficácia do medicamento terapêutico conforme bem como para minimizar os efeitos colaterais indesejáveis ​​e possível resistência microbiana aos medicamentos. Isso foi atribuído às características de distribuição melhoradas, melhor absorção celular e maior eficácia contra patógenos extracelulares e intracelulares.19

Polissacarídeos como pectina, quitosana, quitosana, goma guar, alginato de sódio e hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) foram extensivamente investigados para desenvolver hidrogéis oculares, incorporando NPs mucoadesivos. Um número limitado de estudos investigou o potencial ocular de incorporação de NPs PLGA em hidrogéis como; géis de alginato-quitosana in-situ, 20 géis termossensíveis Poloxamer 407, 21 e géis mucoadesivos Carbomer 934.22 Aqui, os hidrogéis de HPMC carregados com PLGA NP foram desenvolvidos em uma tentativa de fundir as vantagens de PLGA NPs e hidrogéis de HPMC e desenvolver uma Um sistema de distribuição de droga que pode resolver a desvantagem da drenagem rápida dos NPs aquosos, evitar a liberação repentina da droga carregada na superfície e prolongar o tempo de residência da droga pré-córnea. As variáveis ​​que influenciam o desenvolvimento de NPs PLGA carregados com NFX (NP1 - NP8), de acordo com o planejamento fatorial completo 21,41, foram investigadas. Com base na análise estatística das variáveis ​​dependentes, os NPs mais bem alcançados foram incorporados aos hidrogéis baseados em HPMC. A atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa e a segurança histopatológica dos melhores sistemas alcançados foram exploradas.

Norfloxacin (NFX) foi recebido como um gentil presente de Eipico (Cairo, Egito). Poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA; PURASORB® PDLG 5002 (copolímero terminado em éster de DL-lactídeo: glicolídeo em uma razão molar de 50/50; viscosidade de ponto médio inerente = 0,2 dL / g) e PURASORB PDLG 5002A (carboxílico copolímero ácido-terminado de DL-lactídeo: glicolídeo em uma razão molar de 50/50; viscosidade de ponto médio inerente = 0,2 dL / g) foram adquiridos de Purac Biomaterial (Ingelheim, Alemanha) Álcool polivinílico (PVA; MW 95.000) foi adquirido de Sigma -Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Alemanha) O tubo de membrana semipermeável Spectra Por © (12-14 kDa) foi derivado de Spectrum Laboratories Inc, (Rancho Dominguez, CA) Hidroxipropilmetilcelulose K4M (HPMC) foi adquirido de Loba Chemie pvt. Ltd ., (Mumbai, Índia) Cloreto de sódio, hidrogenofosfato dissódico, di-hidrogenofosfato de potássio e clorofórmio foram adquiridos de El-Nasr Pharmaceutical Chemicals Co. (Cairo, Egito). Todos os outros produtos químicos eram de grau analítico e usados ​​como recebidos.

NPs de PLGA carregados com NFX foram preparados por uma técnica de emulsão dupla / evaporação de solvente modificada.23 Soluções de NFX (0,3%) e copolímeros de PLGA terminados em éster ou ácido em quatro proporções (droga: polímero) (1: 0,5, 1 : 1, 1: 1,5 ou 1: 2) foram preparados em clorofórmio, à temperatura ambiente, com agitação magnética (Jenway 1200, Staffordshire, UK). A emulsão a / o primária foi desenvolvida após a incorporação da solução de PVA em água desionizada (1,5%, p / v) na fase orgânica com homogeneização em alta velocidade (homogeneizador Heidolph DIAX 900, Kelheim, Alemanha). Uma emulsão a / o / a foi desenvolvida após a adição da emulsão primária, de forma gota a gota a uma taxa constante (0,5 mL / min), à fase contínua (solução de PVA 1,5%, p / v) com agitação magnética. A emulsão foi deixada com agitação suave durante a noite para permitir a evaporação do solvente. Os NPs foram separados por centrifugação a 15.000 rpm por 30 min a 4 ° C usando uma centrífuga de resfriamento (Sigma 3-30 KS, Osterode am Harz, Alemanha) e lavados com água desionizada. A composição da fórmula investigada é mostrada na Tabela 1. Tabela 1 As variáveis ​​independentes e os dados de caracterização das NPs de PLGA carregadas com NFX derivadas do projeto fatorial

Tabela 1 As variáveis ​​independentes e os dados de caracterização dos NPs de PLGA carregados com NFX derivados do projeto fatorial

As variáveis ​​de formulação que influenciam o projeto de NPs PLGA carregados com NFX foram selecionados usando 21,41 projeto fatorial completo. Duas variáveis ​​independentes foram avaliadas, tipo de polímero (X1) em dois níveis e proporção fármaco: polímero (X2) em quatro níveis. As respostas dependentes foram tamanho de partícula (PS, Y1), magnitude do potencial zeta (ZP, Y2), porcentagem de eficiência de aprisionamento de droga (EE%, Y3), porcentagem de droga liberada após 30 min (Q30min, Y4) e 12 horas (Q12h, Y5 ), a porcentagem de droga permeada através das córneas de cabra após 30 min (P30min, Y6) e 12 horas (P12h, Y7). Os resultados foram analisados ​​estatisticamente usando o software Design-Expert® versão 11 (Stat Ease, Inc., Minneapolis, MN, EUA) para explorar a significância de cada variável via ANOVA.

O tamanho de partícula (PS), índice de polidispersidade (PDI) e potencial zeta (ZP) de NPs de PLGA carregados com NFX foram medidos após diluição apropriada, em triplicados, via espalhamento de luz laser dinâmica (Malvern Zetasizer Nano ZS Zen 3600, Worcestershire, Inglaterra ) a 25 ± 0,5 ° C. A última técnica analisa a flutuação de intensidade de um feixe de laser espalhado causado pelo movimento aleatório browniano das partículas, em um ângulo de 90º, em função do tempo.24 Os dados foram analisados ​​para determinar o coeficiente de difusão, necessário para estimar o diâmetro hidrodinâmico de NPs com base na equação de Stoke-Einstein.25

A porcentagem de eficiência de aprisionamento da droga (EE%) foi medida por um método indireto. Resumidamente, a dispersão de NP foi centrifugada (Heraeus Megafuge 1.0 R; Hanau, Alemanha) a 10.000 rpm durante 15 min. A quantidade de NFX livre no sobrenadante foi medida espectrofotometricamente a um λmax predeterminado de 281 nm (espectrofotômetro Shimadzu UV 1650 UV-VIS; Kyoto, Japão). EE% foi determinado usando a equação (1) (1)

Os estudos de liberação in vitro de NFX de NPs de PLGA carregados com NFX foram realizados em um aparelho testador de dissolução USP (tipo II) (Pharmatron DIS 6000, Thun, Suíça). Uma amostra de cada dispersão de NPs carregada com droga (0,3%) foi colocada em um tubo cilíndrico de vidro que foi firmemente coberto com um tubo de membrana semipermeável Spectra Por © de uma das extremidades. O tubo carregado com dispersão foi preso com laços de zíper de plástico à pá do aparelho. Este último foi ajustado para girar (25 rpm) em um volume de 50 mL de fluido lacrimal simulado (STF, pH 7,4) a 34 ± 0,5 ° C para simular a temperatura da superfície ocular.26 Amostras de alíquotas (3 mL) foram retiradas até 12 horas e foram imediatamente reabastecidos com volumes iguais de meio de dissolução fresco. As porcentagens de droga liberadas foram determinadas espectrofotometricamente a λmax 281 nm, conforme observado anteriormente. Os estudos foram realizados em triplicatas e os valores médios (± DP) das porcentagens de drogas liberadas foram plotados versus tempo.27 As porcentagens de drogas liberadas após 30 min (Q30min) e 12 horas (Q12h) foram calculadas. Estudos paralelos de liberação de drogas in vitro de uma suspensão aquosa de NFX (0,3%) foram conduzidos para investigar o potencial de NPs.

As córneas de cabra são comumente usadas para estudar a permeabilidade transcorneal de drogas.28,29 Dentro de 30 minutos após o sacrifício dos animais, globos oculares inteiros e frescos de cabras foram obtidos em um matadouro local, embebidos em solução salina normal e transportados para o laboratório em um cadeia fria. As córneas cuidadosamente preservadas e o tecido escleral circundante (5–6 mm) foram armazenados em STF recém-preparado; pH 7,4.

Os estudos de permeação de fármacos na córnea ex vivo foram realizados, em triplicata, conforme observado antes nos estudos de liberação de fármacos in vitro. No entanto, os tubos cilíndricos de vidro foram firmemente cobertos com as córneas de cabra excisadas (em vez do tubo de membrana semipermeável) de tal forma que as superfícies epiteliais estavam voltadas para as dispersões de NP. As porcentagens de fármaco permeadas após 30 min (P30min) e 12 horas (P12h) foram calculadas. Estudos paralelos de permeação de droga na córnea ex vivo de NPs livres de drogas (controle) e uma suspensão aquosa de NFX (0,3%) foram conduzidos para investigar o efeito de aumento da permeação de NPs.

Os níveis de hidratação da córnea (% HL) foram calculados pelo método gravimétrico.30 Seguindo os estudos de permeação do fármaco na córnea ex vivo, as córneas foram cuidadosamente removidas, suavemente enxugadas com papel de filtro para remover qualquer água superficial e pesadas (Ww). As córneas foram dessecadas a 100 ° C por 6 horas e pesadas novamente para determinar o peso seco da córnea (Wd). O HL da córnea% foi definido usando a equação (2) (2)

As fórmulas mais bem alcançadas foram elaboradas com base nos valores do índice de desejabilidade (DI) estimado. Um índice de desejabilidade de 1 expressa uma fórmula completamente desejável, enquanto um índice de desejabilidade de 0 expressa uma completamente indesejável.31 A fórmula ótima foi proposta para atingir um compromisso com 7 respostas dependentes (minimizar; PS, Q30min e P30min, e maximizar; ZP magnitude, EE%, Q12h e P12h).

A topografia dos NPs foi digitalizada usando um microscópio eletrônico de transmissão (Philips CM-10, Eindhoven, Holanda). Amostras representativas de NP2 e NP6 foram coradas (solução de ácido fosfotúngstico 2%) para examinar sua uniformidade de forma, tamanho e presença de agregados.32 Micrografia digital e software de visualização de imagem digital Olympus (Alexandra, Cingapura) foram usados ​​para capturar e analisar imagens .

Amostras representativas de NP2 e NP6 foram pré-congeladas a -40 ° C por 2 horas e, em seguida, liofilizadas a -40 ° C por 48 horas. Os espectros FT-IR do fármaco (NFX), polímero PLGA terminado em éster ou ácido, fármaco: misturas físicas de polímero 1: 1 e as amostras liofilizadas foram registrados em espectrofotômetro FT-IR (Genesis II Mattson, EUA) entre 4500 cm − 1 e 500 cm − 1 pela técnica do disco de brometo de potássio.

Os hidrogéis foram preparados dispersando gradualmente as quantidades calculadas de HPMC K4M (1,5 ou 3%, p / p) na metade da quantidade necessária de água desionizada a 70 ° C, enquanto se agitava. As dispersões foram mantidas durante a noite em um refrigerador para obter hidrogéis transparentes sem bolhas de ar. Os volumes finais de hidrogel foram ajustados com água desionizada após a incorporação das fórmulas liofilizadas ótimas; NP2 ou NP6 para que a concentração final do medicamento seja 0,3%. A composição dos hidrogéis investigados (G1 - G4) é mostrada na Tabela 2. Tabela 2 Os dados de composição e caracterização dos hidrogéis carregados com NFX carregados com NFX PLGA NP

Tabela 2 Os dados de composição e caracterização dos hidrogéis carregados com NFX carregados com NFX carregados com NFX

A aparência, cor, homogeneidade e clareza dos géis foram avaliados visualmente sob luz contra fundos brancos e pretos. Os valores de pH dos hidrogéis adequadamente diluídos (1:10) foram medidos em triplicatas (medidor de pH; Griffin e George Ltd., Londres, Inglaterra).

A espalhabilidade dos géis foi determinada usando 2 lâminas de vidro. O gel (0,5 g) foi colocado sobre uma delas, enquanto a outra lâmina foi colocada de forma que o gel ficasse ensanduichado entre elas. Um peso definido foi colocado sobre a lâmina superior e foi deixado por 5 minutos para que o gel fosse pressionado uniformemente para formar uma camada fina e não se esperasse mais espalhamento. A distância percorrida pelo gel foi determinada.

Os comportamentos reológicos dos hidrogéis foram avaliados em diferentes taxas de cisalhamento usando um viscosímetro digital de cone e placa (DV-III Programmable Brookfield Rheometer, Stoughton, MA) equipado com um fuso # 52. Cerca de 0,5 gm de cada hidrogel foi aplicado à placa, e a taxa de cisalhamento foi gradualmente aumentada em uma faixa adequada para dar valores de torque entre 0,1 a 240 rpm, com 30 segundos entre cada 2 pontos sucessivos. O padrão de fluxo de cada hidrogel foi estimado em triplicatas traçando a taxa de cisalhamento versus os valores de tensão de cisalhamento. Os dados reológicos (ɳ min, ɳ max, constante de Farrow e área do loop de histerese) foram estimados. Além disso, a equação de Farrow (3) foi aplicada para explorar o comportamento do fluxo dos géis.26 (3)

Onde; É a taxa de cisalhamento (sec − 1), É a tensão de cisalhamento (dine / cm2), É a viscosidade (cp) e N (constante de Farrow) é a inclinação do log D contra o log S plot.

Os estudos de liberação in vitro de NFX dos hidrogéis carregados com a droga (0,3%) PLGA NP-carregados foram conduzidos usando tubo de membrana semipermeável, em triplicado, conforme observado antes para NPs carregadas com a droga. As porcentagens médias (± DP) de drogas liberadas foram plotadas versus tempo. O Q30min e o Q12h foram calculados e comparados com aqueles das fórmulas NPs ideais (NP2 e NP6).

Os estudos de permeação de droga da córnea ex vivo de NFX dos hidrogéis carregados de PLGA NP carregados com droga (0,3%) foram conduzidos usando córneas de cabra excisadas, em triplicado, como observado antes para NPs carregados com droga. As porcentagens médias (± DP) de drogas permeadas foram plotadas versus tempo. O P30min e P12h foram calculados e comparados com aqueles das fórmulas NPs ótimas (NP2 e NP6).

A cepa bacteriana foi identificada e preparada em soro fisiológico estéril como segue, Pseudomonas aeruginosa cepa ATTC 27.853 foi obtida para preparar uma suspensão de células em soro fisiológico estéril. Este último foi ajustado para 0,5 unidades de McFarland e a suspensão foi inoculada para dar uma concentração final de 105 UFC / mL. Esta suspensão foi usada para testes de sensibilidade in vitro.

A atividade antibacteriana da fórmula preparada recentemente foi testada com o método de difusão em copo de ágar (poço) contra a cepa de Pseudomonas aeruginosa. Volumes fixos do ágar nutriente (20 mL) foram semeados com o microrganismo teste (0,2 mL) e, em seguida, permitiu a solidificação em placas de Petri. Copos de 10 mm de diâmetro foram perfurados assepticamente nas placas. Cem µL de cada hidrogel de PLGA NP carregado com droga (0,3%) foram colocados nos copos. Após manter as placas por 4 horas a 25 ± 0,5 ° C, elas foram incubadas por 24 horas a 37 ° C. As zonas de inibição foram observadas.

Os sistemas mais bem alcançados (G3, G4) foram esterilizados por filtração via passagem por um filtro de membrana estéril com tamanho de poro de 0,22 µm (tipo Millipore). Os estudos de atividade antimicrobiana in vivo foram realizados em 16 coelhos de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e Visão. Os coelhos (2–2,5 kg) foram derivados do biotério Kasr Al-Aini, Faculdade de medicina, Universidade do Cairo. Os animais foram aclimatados em sala climatizada com ciclos diurnos e noturnos alternados (12 horas cada) por uma semana antes do início dos estudos. Eles receberam comida verde e água ad libitum, e foram verificados diariamente para qualquer anormalidade clinicamente observável, incluindo infecções e / ou lesões oculares. O protocolo dos estudos foi aprovado (Ph 06, Jan 2020) pelo Comitê de Ética em Pesquisa da faculdade de ciências farmacêuticas e fabricação de medicamentos da Misr University for Science and Technology, Egito.

Os coelhos foram sedados por injeção intramuscular de 1 mL de Ketalar® (cloridrato de cetamina, 50 mg / mL). Os sacos conjuntivais foram lavados com 2–3 gotas de colírio Isopto® Fenicol (cloranfenicol, 0,5%) para remover quaisquer patógenos existentes. As córneas dos coelhos foram marcadas com uma trefina corneana de 7 mm. O epitélio da superfície foi removido por raspagem. A suspensão de esporos da cepa bacteriana (100 μL, 500.000 esporos) foi inoculada (intraestromal) inserindo uma agulha de calibre 27 no centro da córnea a uma profundidade de aproximadamente metade da espessura da córnea.

Os coelhos foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos, cada grupo incluía 4 coelhos. Em todos os grupos, os olhos direitos foram inoculados com Pseudomonas aeruginosa enquanto os olhos esquerdos serviram como controles. Os integrantes do Grupo 1 e do Grupo 2 foram tratados duas vezes ao dia com G3 e G4, respectivamente. Para comparação, os membros do Grupo 3 foram tratados quatro vezes ao dia com suspensão de NFX (0,3%). Os tratamentos foram iniciados 48 horas após a inoculação e continuados por 10 dias. Nenhum tratamento foi fornecido aos membros do Grupo 4 (grupo infectado).

Os olhos dos coelhos foram examinados diariamente em busca de sinais de infecção. Além disso, a gravidade da reação inflamatória, bem como a profundidade e o tamanho da úlcera da córnea, o edema do estroma e a evidência de vascularização foram monitorados. A recuperação do epitélio de superfície para cada coelho foi registrada. Em uma linha paralela, a cicatrização da úlcera de córnea e a melhora da cobertura epitelial foram verificadas com o uso do corante de fluoresceína. Os olhos de cada coelho foram fotografados para explorar os sinais de melhora, se houver. Vale ressaltar que o oftalmologista ficou cego quanto ao tipo de tratamento e à medicação.

Ao final do período de tratamento, os animais foram sacrificados. As córneas foram excisadas na margem do limbo e cada córnea foi submetida à avaliação histopatológica. As amostras de tecido foram fixadas e processadas conforme descrito por Culling.35 As amostras foram fixadas em formalina tamponada neutra a 10% por 72 horas, processadas em graus seriais de etanol, depuradas em xileno, infiltradas e incluídas em blocos de cera de parafina. Cortes de tecido (5µ de espessura) foram cortados (micrótomo rotatório), montados em lâminas de vidro e corados por hematoxilina e eosina como coloração padrão para exames histológicos gerais. As regiões da córnea de diferentes amostras foram examinadas e fotografadas usando um microscópio full HD acoplado a um microscópio Leica. As imagens foram processadas com o software aplicativo Leica (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemanha).

NPs de PLGA carregados com NFX foram preparados por meio da técnica de emulsão dupla / evaporação de solvente. Essa técnica é comumente usada para preparar NPs porque é simples, reproduzível, possui um número limitado de variáveis ​​de processo controláveis ​​e pode ser facilmente ampliada.23,36 NFX é ligeiramente solúvel em clorofórmio (5,5 mg / mL; 25 ° C) .37 A uma dose de 0,3%, o fármaco e o PLGA foram dissolvidos em clorofórmio. Esperava-se que isso aumentasse a possibilidade de interação entre a droga e o núcleo hidrofóbico do polímero. Pode-se inferir que o NFX teria menos probabilidade de se mover junto com o clorofórmio durante o escape rápido do solvente para a fase aquosa externa e, portanto, um alto teor de EE% do fármaco poderia ser esperado.38 A incorporação de solução de PVA (1,5%, w / v) foi necessário desenvolver pequenas partículas com distribuições de tamanho de partícula uniformes.39 O PVA pode diminuir a tensão interfacial na interface fase orgânica-água, prevenir a agregação de NPs e / ou preservar sua integridade.40

Para o desenvolvimento de NPs de PLGA carregados com NFX, um fator categórico (tipo de polímero, A) e um fator numérico (proporção droga: polímero, B) foram investigados. Os resultados foram analisados ​​e as equações finais (4–10) para as respostas (Y1 - Y7) foram obtidas em termos de fatores codificados como segue, (4) (5) (6) (7) (8) (9) ( 10)

onde, B [1], B [2] e B [3] são os coeficientes do fator numérico multinível.

Os valores de R2 de todas as variáveis ​​foram relativamente altos, indicando que os dados derivados eram estatisticamente válidos. Os termos do modelo são considerados significativos quando o valor de p é ≤ 0,05. A Tabela 3 mostrou que, exceto para Q12h e P12h, os valores de R2 predito e ajustado de todas as respostas estavam em concordância aceitável, uma vez que a diferença entre eles era menor que 0,2,41. . As conclusões foram apresentadas pelo uso de equações polinomiais após considerar as magnitudes dos coeficientes e o sinal matemático (negativo ou positivo). Um sinal negativo significa um efeito antagônico, enquanto um positivo representa uma influência sinérgica.42 Tabela 3 Os dados de análise de projeto fatorial das respostas de NPs de PLGA carregados com NFX

Tabela 3 Os dados de análise de projeto fatorial das respostas de NPs PLGA carregados com NFX

Quanto menor o tamanho da partícula, maior a área de superfície e mais rápida a taxa de liberação do fármaco in vitro.43 Os resultados da ANOVA mostraram que o tipo de polímero e a razão fármaco: polímero tiveram efeitos significativos no tamanho de partícula com valores P de 0,0003 e 0,0161, respectivamente. O tamanho médio de partícula é preparado com polímeros de PLGA terminados em éster ou terminados em ácido variando de 356,13 nm (NP1) a 485,05 nm (NP4) e de 176,07 nm (NP5) a 256,12 nm (NP8), respectivamente (Tabela 1). Ficou claro que os NPs preparados com polímeros PLGA terminados em éster eram maiores do que os NPs correspondentes preparados com polímeros PLGA terminados em ácido. Os últimos NPs são mais hidrofílicos e possuem grupos carboxilato carregados negativamente e, portanto, mais interações com água seriam esperadas para diminuir o tamanho de NPs.44 Em uma linha paralela, as repulsões eletrostáticas entre as partículas entre os grupos carboxilato seriam esperadas para minimizar o possíveis colisões de NPs e, portanto, reduzir o tamanho da partícula.44

A correlação direta foi estabelecida entre a proporção fármaco: polímero e o tamanho de partícula. Esta correlação é verdadeira, independentemente do tipo de polímero. Pode-se inferir que o uso de uma concentração de polímero mais alta aumentaria a viscosidade da solução de polímero na fase orgânica e, portanto, aumentaria o tamanho de NPs.45

PDI é uma medida da largura (uniformidade) da distribuição do tamanho das partículas. Um valor PDI próximo a 0 indica uma dispersão homogênea, enquanto um valor PDI próximo a 1 descreve uma população totalmente heterogênea e polidispersa. Os valores de PDI de todos os NPs foram pequenos (<0,3), indicando boa homogeneidade e distribuições uniformes de tamanho de partícula.46

A agregação de partículas é menos provável de ocorrer se elas forem carregadas positiva ou negativamente com uma magnitude de ≥ 30 mV.47 Os resultados da ANOVA mostraram que o tipo de polímero teve um efeito significativo no ZP com um valor P de 0,0135. PLGA é um copolímero de ácido láctico e ácido glicólico, enquanto NFX é um ácido monocarboxílico de quinolina e, portanto, todos os NPs possuíam valores de potencial zeta negativos. Ficou claro que NPs preparados com polímeros PLGA terminados em ácido tinham maiores magnitudes de ZP [variando de -26,51 (NP5) a -33,62 (NP6)] do que os NPs correspondentes preparados com polímeros PLGA terminados em éster [variando entre [-22,52 ( NP1) a −30,43 (NP2)], possivelmente devido à presença de grupos de ácido carboxílico que foram desprotonados no pH fisiológico.48 Em comparação com NPs carregados positivamente, espera-se que os sistemas carregados negativamente sejam menos citotóxicos, uma vez que os primeiros podem causam lise celular ao romper a membrana.15,49 Nenhuma correlação direta foi revelada entre a proporção fármaco: polímero e o ZP, confirmando a contribuição não significativa desse fator no ZP. No entanto, é importante notar que magnitudes significativamente (P <0,05) maiores de valores de ZP foram alcançadas com NPs de PLGA preparados em uma proporção fármaco: polímero de 1: 1, independentemente do tipo de polímero.

Os resultados da ANOVA confirmaram que o tipo de polímero e a razão fármaco: polímero tiveram efeitos significativos no EE% com valores P de 0,0288 e 0,0119, respectivamente. A EE% média para NPs preparados com polímeros PLGA terminados em éster ou ácido variou de 37,80% (NP1) a 79,24% (NP2) e de 59,63% (NP5) a 91,72% (NP8), respectivamente (Tabela 1). As altas porcentagens de EE do fármaco de NPs de PLGA podem estar relacionadas à natureza lipofílica do NFX, que tem baixa afinidade para a fase aquosa e tende a permanecer, junto com o PLGA, no domínio orgânico.

Ficou claro que os NPs preparados com polímeros PLGA terminados em ácido tinham EE% maior do que os NPs correspondentes preparados com polímeros PLGA terminados em éster. Isso pode ser atribuído à forte afinidade entre o grupo amina carregado positivamente em NFX e os grupos carboxilato carregado negativamente na cadeia do polímero.

Uma relação direta foi observada entre a proporção fármaco: polímero e EE%. Esta correlação é aceitável até uma proporção fármaco: polímero de 1: 1. De acordo com Thread e cols.50, o EE% do fármaco é afetado pela drenagem do fármaco aprisionado durante a expulsão do solvente. Em uma proporção ideal de fármaco: polímero, o fármaco% EE é melhorado, possivelmente devido ao emaranhado estendido do fármaco com as cadeias de polímero, bem como o encolhimento e / ou drenagem lenta do fármaco aprisionado durante a expulsão do solvente. A diminuição na% EE do fármaco foi revelada além de uma proporção fármaco: polímero de 1: 1, independentemente do tipo de polímero. Isso pode ser devido ao revestimento de polímero mais compacto, que necessita de um tempo maior para a precipitação do polímero. Esses achados estão de acordo com os relatados por Motwani e cols.51, que revelaram uma relação inversa entre a concentração do polímero (quitosana-alginato) e gatifloxacina EE%. Em concentrações mais altas de polímero, seria esperado que o polímero constituísse a maior parte da matriz de NPs e, portanto, um volume mais baixo estaria disponível para encapsulamento do fármaco. Em linha paralela, Zhang e cols.52 mostraram que a natureza altamente viscosa do meio de gelificação, em concentrações mais elevadas de polímero, dificultaria o encapsulamento da albumina sérica bovina em microesferas de alginato de quitosana.

Os estudos de liberação in vitro de NFX dos NPs investigados e uma suspensão aquosa de fármaco são ilustrados na Figura 1A. Ficou claro que ≈ 95,5% de NFX foi liberado da suspensão aquosa em 6 horas, indicando a difusão não impedida do fármaco através da membrana de diálise. Ao contrário, os perfis de liberação bifásica do fármaco foram revelados com NPs de PLGA. Cada perfil de liberação de droga mostrou uma liberação inicial rápida seguida por uma fase de liberação de droga mais prolongada. A primeira fase poderia ser atribuída às frações do fármaco serem fracamente ligadas, adsorvidas ou localizadas próximo à superfície dos NPs, durante a eliminação intensa do solvente, devido à sua natureza hidrofóbica.53 A liberação inicial do fármaco é benéfica, em termos de atividade antibacteriana, para atingir a concentração mínima efetiva do fármaco. Uma fase de liberação prolongada do fármaco foi subsequentemente alcançada, provavelmente devido à partição prolongada das frações restantes do fármaco na fase aquosa externa. Esta fase foi necessária para manter uma concentração de droga eficaz por um período prolongado.54Figura 1 (A) Perfis de liberação in vitro de NFX de NPs de PLGA carregados com NFX e suspensão de NFX em fluido lacrimal simulado (pH 7,4), média ± DP, n = 3. (B) Perfis de permeação corneana de cabra ex vivo de NFX de NPs de PLGA carregados com NFX e suspensão de NFX em fluido lacrimal simulado (pH 7,4), média ± DP, n = 3. Abreviações: NFX, norfloxacina; PLGA, poli (ácido láctico-co-glicólico); NPs, nanopartículas.

Figura 1 (A) Perfis de liberação in vitro de NFX de NPs de PLGA carregados com NFX e suspensão de NFX em fluido lacrimal simulado (pH 7,4), média ± DP, n = 3. (B) Perfis de permeação corneana de cabra ex vivo de NFX de NFX NPs carregados de PLGA e suspensão de NFX em fluido lacrimal simulado (pH 7,4), média ± DP, n = 3.

Abreviaturas: NFX, norfloxacina; PLGA, poli (ácido láctico-co-glicólico); NPs, nanopartículas.

O Q30min e Q12h dos NPs preparados com os polímeros PLGA terminados em ácido foram significativamente (P <0,05) maiores do que os NPs correspondentes preparados com os polímeros PLGA terminados em éster. As NPs anteriores são menores em tamanho e, portanto, um comprimento de caminho de difusão mais curto seria encontrado para alcançar a interface da fase aquosa. Além disso, a maior hidrofobicidade dos polímeros PLGA terminados em éster poderia diminuir o umedecimento, hidratação e transição das camadas superficiais do estado sólido vítreo para o estado gelatinoso borrachoso após contato com a fase aquosa, resultando assim em taxas de liberação de droga mais baixas. Esses achados estavam de acordo com aqueles relatados por Ravi e cols.55 que revelaram que o polímero com grupos terminais carboxílicos, RG 502 H, apresentou baixa liberação inicial de explosão em comparação com 502. Isso pode ser devido à hidrofilicidade do polímero que causa interação favorável entre grupos terminais carboxílicos nas cadeias poliméricas e proteínas.

Uma correlação inversa foi estabelecida entre Q30min ou Q12h e a proporção fármaco: polímero. A maior concentração de polímero aumentaria a formação de camadas de gel viscoso em torno do microambiente de NPs. As camadas de gel cresceriam lentamente à medida que a fase aquosa penetra em direção ao núcleo. Isso aumentará gradualmente a espessura da camada de gel e, portanto, prolongará o comprimento do caminho de difusão do fármaco.

A permeação de droga na córnea ex vivo a partir da suspensão de NFX e NPs de PLGA foi estudada usando córneas de cabra, Figura 1B. O P12h da suspensão NFX foi de 26,13% enquanto o P12h dos NPs variou de 40,12% (NP4) a 70,12% (NP5). A permeação favorável de NPs carregados com NFX através da córnea pode ser atribuída ao seu tamanho submicrônico e à aglomeração dos NPs no saco conjuntival e a formação de um depósito a partir do qual a droga é lentamente entregue à área pré-córnea. Essas suposições foram relatadas para aceclofenaco, onde a absorção de NPs pela córnea de cabra foi maior (duas vezes) do que a de uma solução aquosa de droga.56 Em uma linha paralela, a permeação da córnea de coelho de NPs de flurbiprofeno mostrou maior permeação de droga (quatro- dobras) sobre a solução de droga em tampão fosfato (pH 7,4).

Os valores de P30min de NPs carregados com NFX foram maiores do que os valores de Q30min correspondentes, mostrando o efeito de aumento da permeação de drogas dos NPs. O último achado pode ser parcialmente atribuído à alta razão área de superfície / volume de NPs, que promoveria um contato facilitado do medicamento com a córnea. Além disso, os efeitos indutores de viscosidade e de aumento de permeação do PVA (um surfactante não iônico) também devem ser considerados. A última sugestão está de acordo com os achados de Malhotra e cols.58, que relataram que as gotas oftálmicas de voriconazol contendo PVA mostraram maior permeação do fármaco na córnea por meio de córneas de cabra recentemente excisadas, em relação a vários indutores de viscosidade.

Curiosamente, os valores de P12h de NPs carregados com NFX foram menores do que os valores de Q12h correspondentes. Esses últimos achados podem estar relacionados à estrutura simples da membrana de diálise (que atua apenas como uma barreira mecânica) e à estrutura complexa da córnea (que é composta de epitélio lipofílico, estroma hidrofílico e endotélio lipofílico). As propriedades físico-químicas do fármaco e a resistência à difusão das barreiras corneanas lipofílicas e hidrofílicas impediriam a permeação do fármaco na córnea ao longo do tempo.57

Os perfis de permeação de drogas de NPs correspondem aos perfis de liberação de drogas in vitro. O observado anteriormente para Q30min e Q12h, os valores de P30min e P12h de NPs preparados com polímeros PLGA terminados em ácido foram significativamente (P <0,05) maiores do que seus NPs correspondentes preparados com polímeros PLGA terminados em éster. Em uma linha paralela, uma correlação inversa foi observada entre P30min ou P12h e a proporção fármaco: polímero, independentemente do tipo de polímero.

A determinação do nível de hidratação da córnea é comumente usada para avaliar possíveis danos à córnea. O nível de hidratação relatado das córneas normais varia entre 76 e 80% .57 Aqui, a hidratação da córnea de todos os NPs variou entre 81,93 (NP6) a 83,12% (NP4), Tabela 1. Pode-se inferir que os NPs desenvolvidos não causar qualquer dano ao tecido da córnea, uma vez que um nível de hidratação inferior a 3–7% acima do valor normal é relatado como inofensivo.59

A escolha do sistema mais bem alcançado baseou-se na transformação da resposta estimada (Y1 - Y7) em um índice de desejabilidade. Com base nas restrições definidas (minimizar o PS, Q30min e P30min, e maximizar a magnitude de ZP, EE%, Q12h e P12h, Tabela 1), os NPs de PLGA terminados em éster mais bem alcançados (NP2, índice de desejabilidade 0,6) e os melhores NPs de PLGA terminados em ácido alcançados (NP6, índice de desejabilidade 0,57) NP6) foram escolhidos para estudos adicionais.

Micrografias de TEM representativas de NP2 e NP6 foram fornecidas na Figura 2A e B, respectivamente. Ficou claro que NPs esféricos discretos foram desenvolvidos. A tendência não agregada dos NPs desenvolvidos pode estar relacionada à estabilização eletrostática (alta magnitude de potencial zeta negativo) e também estérica (PVA). Durante a evaporação do clorofórmio, a viscosidade da emulsão aumentaria e poderia aumentar a coalescência das gotículas da emulsão. A incorporação de PVA na fase aquosa forneceria uma fina película protetora ao redor das gotículas e, portanto, estereoticamente impediria sua agregação e manteria sua integridade.23,40 Os NPs parecem ter tamanhos de partícula menores do que aqueles obtidos por meio de medições DLS. Isso pode estar relacionado à possível agregação de NPs durante a estimativa do diâmetro hidrodinâmico. Além disso, a presença de partículas maiores discretas na dispersão de NPs pode causar maior dispersão de luz e, portanto, o tamanho de partícula muda para um valor maior. O tamanho e a forma dos NPs podem influenciar seu possível potencial de irritação ocular. As partículas isométricas que possuem ângulos e bordas obtusos, como NPs esféricos, são menos irritantes para a superfície ocular do que aquelas que possuem ângulos e bordas agudas.56Figura 2 Micrografias eletrônicas de transmissão de NP2 (A) e NP6 (B). Abreviatura: NP, nanopartículas.

Figura 2 Micrografias eletrônicas de transmissão de NP2 (A) e NP6 (B).

Estudos de FT-IR foram realizados para detectar qualquer possível interação droga-polímero (Figura 3). O espectro FT-IR do NFX apresentou um largo pico característico entre 3500 cm-1 e 3550 cm-1, que pode estar relacionado ao alongamento da vibração do grupo -OH, bem como à possível ligação de hidrogênio intermolecular. A banda em 3200 cm-1 a 3300 cm-1 pode ser atribuída à vibração de alongamento NH da porção imino dos grupos piperazinil. O pico em 1670 cm-1 pode ser atribuído a C = vibração de alongamento. O pico em 1550 cm-1 pode ser referido como a vibração de alongamento OCO do ácido. O pico em 1420 cm-1 foi sugerido como sendo atribuído à vibração de flexão do grupo OH.60 O espectro FT-IR do PLGA terminado mostrou as vibrações de alongamento -CH, -CH2, -CH3 entre 2850 cm-1 e 2950 cm-1. A banda em 1770 cm-1 foi atribuída à vibração de alongamento de C = O grupo que está presente em ambos os monômeros (lactídeo e glicolídeo), enquanto as bandas na faixa de 1040 cm-1 - 1200 cm-1 foram atribuídas ao Vibração de alongamento de CO (Figura 3A2). Esses picos característicos foram comparáveis ​​aos relatados por Fu e cols.61 para PLGA. Os picos característicos de NFX foram mantidos no espectro FT-IR da mistura física droga-polímero (Figura 3A3), bem como no espectro FT-IR da amostra liofilizada de NP2 (Figura 3A4). Além disso, os novos picos foram desenvolvidos; mostrando a presença de interações químicas mínimas entre NFX e o PLGA terminado com éster. Figura 3 (A) Espectros FT-IR de NFX (1), PLGA terminado com éster (2), mistura física PLGA terminada com éster NFX (3) e NFX liofilizado NP2 carregado (4). (B) Espectro FT-IR de NFX (1), PLGA terminado com ácido (2), mistura física PLGA terminado com ácido NFX (3) e NP6 carregado com NFX liofilizado (4). Abreviaturas: FT-IR, infravermelho com transformada de Fourier; NFX, norfloxacina; PLGA, poli (ácido láctico-co-glicólico); NPs, nanopartículas.

Figura 3 (A) Espectro FT-IR de NFX (1), PLGA terminado com éster (2), mistura física PLGA terminado com éster NFX (3) e NP2 carregado com NFX liofilizado (4). (B) Espectro FT-IR de NFX (1), PLGA terminado com ácido (2), mistura física PLGA terminado com ácido NFX (3) e NP6 carregado com NFX liofilizado (4).

Abreviaturas: FT-IR, infravermelho com transformada de Fourier; NFX, norfloxacina; PLGA, poli (ácido láctico-co-glicólico); NPs, nanopartículas.

Por outro lado, o espectro FT-IR do PLGA terminado com ácido apresentou um pico característico amplo em 3500 cm-1 que pode estar relacionado à vibração de alongamento do grupo - OH de ambos os monômeros (Figura 3B2). As vibrações de alongamento -CH, -CH2, -CH3, as vibrações de alongamento C = e as vibrações de alongamento CO foram reveladas de forma semelhante, conforme observado com o PLGA terminado em éster.61 Os picos característicos de NFX não foram alterados no espectro FT-IR da mistura física droga-polímero (Figura 3B3). No entanto, o espectro FT-IR da amostra liofilizada de NP6 (Figura 3B4) mostrou um pico amplo entre 3400 cm-1 que poderia estar relacionado à ligação de hidrogênio intermolecular entre grupos -OH de NFX e o PLGA terminado em ácido.

A baixa absorção ocular dos fármacos pode ser atribuída a diversos fatores, como a taxa de renovação lacrimal e a rápida drenagem do sistema com perda de 70 a 80% do fármaco. Além disso, os freqüentes esquemas de dosagem de colírios por períodos prolongados podem influenciar negativamente o olho.62 Historicamente, os colírios foram introduzidos porque possuem alta viscosidade e não podiam ser drenados rapidamente do olho. Infelizmente, eles geralmente causam visão turva e induzem baixa adesão do paciente.63 Em vista do exposto, a incorporação de partículas nanoestruturadas (NPs de PLGA carregados com NFX) em matrizes tridimensionais (Hidrogéis HPMC) foi explorada como uma alternativa promissora para o alcance ocular prolongado tempo de residência do medicamento e alcançar uma boa adesão do paciente.

A inspeção visual dos sistemas revelou o desenvolvimento de hidrogéis translúcidos e homogêneos sem sinais de separação ou precipitação. Seus valores de pH variaram de 6,95 (G2) a 7,50 (G3), Tabela 2. Pode-se inferir que esses sistemas são toleráveis, não se espera que causem irritação severa na superfície dos olhos.

A capacidade de espalhar é uma característica importante dos hidrogéis promissores, uma vez que denota a extensão da área na qual o gel se espalha prontamente após a aplicação ocular. Quanto maior a distância percorrida, maior a capacidade de espalhamento do gel.34 Uma correlação inversa foi estabelecida entre a concentração de polímero e a capacidade de espalhamento, possivelmente devido ao desenvolvimento de redes poliméricas mais fortes. G3 e G4 mostraram distâncias mais curtas do que os géis correspondentes que foram preparados na concentração de HPMC mais baixa (G1 e G2), Tabela 2.

Os valores de viscosidade influenciam as características de fluxo dos hidrogéis na aplicação ocular. Uma relação direta foi entre a concentração de polímero e a viscosidade estabelecida. Os valores de viscosidade mínimo e máximo dos géis G3 e G4 foram significativamente (P <0,05) maiores do que os valores correspondentes dos géis G1 e G2, Tabela 2. Os gráficos de tensão de cisalhamento vs taxa de cisalhamento dos sistemas foram representados em Figura 4. Os valores da constante de Farrow (N) foram> 1 em todos os sistemas, variando de 4,68 (G2) a 5,03 (G4), Tabela 2. Pode-se inferir que o fluxo pseudoplástico de cisalhamento foi dominante. Espera-se que esse comportamento reológico promova a distribuição uniforme da droga na superfície da córnea. Figura 4 Comportamento tixotrópico de hidrogéis de HPMC carregados com PLGA NP com NFX (G1 (A), G2 (B), G3 (C) e G4 (D) Abreviaturas: NFX, norfloxacina; PLGA, poli (ácido lático-co-glicólico); NPs, nanopartículas; HPMC, hidroxipropilmetilcelulose K4M.

Figura 4 Comportamento tixotrópico de hidrogéis de HPMC carregados com PLGA NP carregados com NFX (G1 (A), G2 (B), G3 (C) e G4 (D).

Abreviaturas: NFX, norfloxacina; PLGA, poli (ácido láctico-co-glicólico); NPs, nanopartículas; HPMC, hidroxipropilmetilcelulose K4M.

Uma correlação direta foi observada entre a concentração de polímero e a área do loop de histerese. As áreas dos laços de histerese variaram de 21,03 cm2 (G1) a 31,35 cm2 (G3), Tabela 2. Conforme mostrado na Figura 4, todos os sistemas apresentaram bom comportamento tixotrópico. Isso poderia ser caracterizado pela ruptura progressiva das redes poliméricas internas por cisalhamento crescente e a posterior reconstrução devido ao movimento browniano.

Os perfis de liberação in vitro de NFX dos hidrogéis investigados em fluido lacrimal simulado (pH 7,4) foram representados na Figura 5A. Em comparação com Q30min e Q12h de NP2 e NP6, os valores correspondentes dos hidrogéis desenvolvidos foram significativamente (P <0,05) mais baixos, confirmando o desenvolvimento de perfis de liberação de fármaco mais prolongados. Quando os hidrogéis baseados em HPMC são expostos a um meio aquoso (STF), o polímero se hidrata para formar uma camada de gel e as camadas superficiais passam de um estado sólido vítreo para um estado gelatinoso de borracha. O núcleo do gel, contendo os NPs, permanece essencialmente seco neste estágio. É provável que o medicamento na superfície dos NPs passe para a solução rapidamente, proporcionando um pulso inicial de medicamento. À medida que o fluido penetra em direção aos NPs, a camada de gel cresce progressivamente e o comprimento do caminho de difusão da droga é prolongado. Quando a hidratação completa da camada externa é alcançada, o relaxamento da cadeia do polímero pode produzir uma perda de integridade, desemaranhamento e erosão da matriz, permitindo a liberação prolongada subsequente do fármaco de NPs.65Figura 5 (A) Perfis de liberação in vitro de NFX NFX Hidrogéis de HPMC carregados com PLGA NP carregados em fluido lacrimal simulado (pH 7,4), média ± DP, n = 3. (B) Perfis de permeação corneana de cabra ex vivo de NFX de hidrogéis de HPMC carregados com PLGA NP carregados com NFX em fluido lacrimal simulado (pH 7,4), média ± DP, n = 3. Abreviações: NFX, norfloxacina; PLGA, poli (ácido láctico-co-glicólico), NPs, nanopartículas; HPMC, Hidroxipropilmetilcelulose K4M.

Figura 5 (A) Perfis de liberação in vitro de NFX de hidrogéis HPMC carregados com PLGA NP carregados com NFX em fluido lacrimal simulado (pH 7,4), média ± DP, n = 3. (B) Perfis de permeação corneana de cabra ex vivo de NFX de Hidrogéis de HPMC carregados com PLGA NP carregados com NFX em fluido lacrimal simulado (pH 7,4), média ± DP, n = 3.

Abreviaturas: NFX, norfloxacina; PLGA, poli (ácido láctico-co-glicólico), NPs, nanopartículas; HPMC, Hidroxipropilmetilcelulose K4M.

Uma correlação inversa pode ser estabelecida entre a concentração de HPMC e Q30min ou Q12h. Pode-se inferir que a maior densidade das cadeias poliméricas nas microestruturas dos géis permitiria um comprimento do caminho de difusão mais retardado do fármaco.

Os perfis de permeação de droga transcorneal ex vivo de NFX a partir dos hidrogéis investigados em fluido lacrimal simulado (pH 7,4) foram representados na Figura 5B. Em comparação com P30min e P12h de NP2 e NP6, ficou claro que as porcentagens correspondentes dos hidrogéis desenvolvidos foram significativamente (P <0,05) menores. Esses achados podem estar relacionados às propriedades mucoadesivas e indutoras de viscosidade de HPMC que podem prolongar marcadamente o tempo de residência do medicamento no saco conjuntival e permitir mais tempo para o medicamento se difundir através das camadas oculares. As vantagens da incorporação de sistemas nanoestruturados em sistemas HPMC oculares foram relatadas anteriormente para muitos medicamentos, como levofloxacina hemihidratado, 67 acetazolamida 68 e voriconazol.69

Todas as fórmulas foram testadas microbiologicamente pelo método de difusão em copo de ágar (poço). Zonas claras de inibição foram obtidas, variando em diâmetro de 23,6 mm (G3) a 37,1 mm (G2) após 24 horas, Tabela 2. Ficou claro que os hidrogéis carregados com PLGA NP6 terminados em ácido (G2 e G4) mostraram zonas maiores de inibição do que os correspondentes hidrogéis carregados com PLGA NP2 terminados em éster (G1 e G3, respectivamente). Conforme observado anteriormente, os sistemas anteriores mostraram valores Q12h significativamente (P <0,05) maiores. Por extrapolação, seria de se esperar que esses sistemas permitissem a liberação de maiores porcentagens de fármaco após um período de incubação de 24 horas e, portanto, aumentaria sua atividade antimicrobiana in vitro. A eficácia desses sistemas contra microrganismos pode ser descrita com vários mecanismos, incluindo, (i) as propriedades mucoadesivas e indutoras de viscosidade de hidrogéis de HPMC, (ii) a fusão de NPs com a parede ou membrana celular microbiana e a liberação do droga dentro do microorganismo, e (iii) a adsorção de NPs à parede celular, onde servem como reservatório para a difusão contínua da droga no microorganismo, e (iv) a maior estabilidade da droga encapsulada em NPs contra rápida degradação enzimática / hidrolítica.70

Levando em consideração o objetivo principal de alcançar taxas de permeação transcorneal mais prolongadas de fármacos por meio de sistemas tixotrópicos com atividades antimicrobianas promissoras, os sistemas G3 e G4 foram promovidos para estudos in vivo adicionais.

Os olhos de todos os coelhos demonstraram características inflamatórias clínicas graves na forma de hiperemia conjuntival e opacidade da córnea devido ao edema do estroma com defeito epitelial sobrejacente (úlcera da córnea) pós-infecção por Pseudomonas aeruginosa. A classificação média das pontuações de opacidade de todos os coelhos infectados mostrou diferenças não significativas (P> 0,05) neste momento, uma vez que todos os grupos mostraram opacidade densa cobrindo todo o segmento anterior. Os coelhos começaram a receber tratamentos 48 horas após a inoculação. Os olhos dos coelhos foram examinados diariamente usando um biomicroscópio portátil com lâmpada de fenda para avaliação da gravidade da reação inflamatória, tamanho e profundidade da úlcera de córnea, edema estromal e evidência de vascularização.

A Figura 6 mostra a hiperemia conjuntival e edema da córnea em coelhos com ceratite induzida por Pseudomonas pré- (A) e 10 dias pós- (B) não tratamento no grupo infectado (a) ou tratamento em suspensão de droga- (b), G3 - (c), grupos G4- (d). Os olhos de todos os coelhos demonstraram hiperemia conjuntival grave e opacidade da córnea (edema do estroma) após infecção com Pseudomonas aeruginosa antes do início do tratamento, Figura 6A. A opacidade da córnea foi pontuada e graduada da seguinte forma, grau 0, os olhos são idênticos ao seu estado original antes da infecção; grau 1, opacidade fraca na área infectada; grau 2, opacidade densa na área infectada; grade 3, opacidade densa cobrindo todo o segmento anterior; grau 4, perfuração da córnea, 71 Tabela 4. Tabela 4 Comparação dos achados clínicos e histopatológicos das seções de tecido da córnea excisadas nos grupos investigados Figura 6 Hiperemia conjuntival e edema da córnea em coelhos com ceratite induzida por Pseudomonas pré- (A) e 10 dias pós- (B) não tratamento no grupo infectado (a) ou tratamento nos grupos suspensão da droga- (b), G3- (c), G4- (d).

Tabela 4 Comparação dos achados clínicos e histopatológicos das seções de tecido da córnea excisadas nos grupos investigados

Figura 6 Hiperemia conjuntival e edema da córnea em coelhos com ceratite induzida por Pseudomonas pré- (A) e 10 dias pós- (B) não tratamento no grupo infectado (a) ou tratamento em suspensão da droga- (b), G3- ( c), grupos G4- (d).

Ao final do período de tratamento, as opacidades da córnea nos grupos de suspensão da droga, G3, G4 eram melhores e apresentavam graus significativamente mais baixos do que as observadas no grupo infectado, Figura 6B. Conforme observado na Tabela 4, opacidade corneana de grau 1 foi revelada nos grupos de suspensão de drogas, G3 e G4, em comparação com o grau 3 no grupo infectado. Isso foi avaliado estatisticamente por meio do teste U de Mann Whitney a P <0,05. Em uma linha paralela, os tamanhos das úlceras nos grupos suspensão da droga, G3 e G4 foram significativamente menores do que os observados no grupo infectado. Eles mostraram melhor resolução do edema estromal, diminuições acentuadas nas áreas de infiltração e tamanhos menores de úlceras.

Os exames histopatológicos das amostras excisadas da córnea foram realizados para avaliar e comparar o grau de lesões da córnea para os hidrogéis carregados de NPs selecionados (G3 e G4) - com aqueles para os grupos de controle, infectados e suspensão de drogas, Figura 7. O grau de dano epitelial de cobertura, a desorganização das fibras de colágeno, a neovascularização e o infiltrado de células inflamatórias em todos os grupos foram resumidos na Tabela 4. Sugere-se que a infecção bacteriana da córnea ocorra em duas etapas. O primeiro envolve a interação da bactéria com a superfície das células epiteliais da córnea. A segunda etapa envolve a penetração da bactéria no estroma, onde as toxinas liberadas mediariam a inflamação grave do tecido e possíveis danos. Após injeções intraestromais, a ceratite é caracterizada por replicação bacteriana marcada e alterações oftálmicas graves, como edema estromal, destruição de células epiteliais da córnea e migração de leucócitos polimorfonucleares para o filme lacrimal.72 Figura 7 Alterações histopatológicas observadas, em duas ampliações, nas seções de tecidos da córnea excisados ​​em diferentes grupos [controle (A), infectado (B), suspensão do fármaco (C), G3 (D), G4 (E)]. A seta preta aponta para a camada epitelial, a seta verde mostra os fibroblastos em proliferação e a seta vermelha refere-se ao infiltrado de células inflamatórias polimorfonucleares. As estrelas denotam a morfologia lamelar do colágeno do estroma (A), neovascularização (B), vasos sanguíneos congestionados / dilatados (C – E).

Figura 7 Alterações histopatológicas observadas, em dois aumentos, nos cortes dos tecidos excisados ​​da córnea nos diferentes grupos [controle (A), infectado (B), suspensão do fármaco (C), G3 (D), G4 (E)]. A seta preta aponta para a camada epitelial, a seta verde mostra os fibroblastos em proliferação e a seta vermelha refere-se ao infiltrado de células inflamatórias polimorfonucleares. As estrelas denotam a morfologia lamelar do colágeno do estroma (A), neovascularização (B), vasos sanguíneos congestionados / dilatados (C – E).

Os olhos de controle mostraram características histológicas normais das camadas da córnea com epitélio de cobertura intacto (seta preta), morfologia lamelar de colágeno estromal bem organizado subjacente (estrela) e membrana limitante posterior intacta com endotélio de revestimento, Figura 7A. Por outro lado, o exame histopatológico dos olhos infectados (Figura 7B) demonstrou amplas áreas de descolamento, desnudamento e perda da camada epitelial de cobertura (seta preta) acompanhada de edema moderado da camada estromal e fibras de colágeno desorganizadas com muitos fibroblastos em proliferação (seta verde )). Em conjunto com a neovascularização (estrela), células inflamatórias polimorfonucleares moderadas a graves foram registradas (seta vermelha). Um alto grau (3) de opacidade da córnea e uma grande úlcera da córnea (9 mm) foram observados.

Em comparação com os olhos infectados, o exame histopatológico dos olhos tratados com suspensão de NFX (Figura 7C), G3 (Figura 7D) ou G4 (Figura 7E) mostrou epitélio quase intacto com espessamento significativo e demonstrou menos infiltrado de células inflamatórias (seta vermelha), edema moderado, pequenas alterações das fibras colágenas no estroma, menor grau de vasos sanguíneos congestionados / dilatados (estrela) e fibroblastos menos proliferantes (seta verde). Em comparação com a suspensão de NFX e os grupos tratados com G4, o grupo tratado com G3 apresentou menor grau de vasos sanguíneos congestionados (dilatados) e infiltrado de leucócitos polimorfonucleares do estroma.

Ao contrário das preparações oculares tradicionais de NFX, os sistemas G3 e G4 permitiriam um tempo de residência prolongado do medicamento na córnea, melhor permeação do medicamento na córnea e menores probabilidades de induzir precipitados de medicamento na córnea. Com os sistemas G3 e G4, níveis prolongados de fármacos terapêuticos poderiam ser mantidos com frequências razoáveis ​​de aplicação (duas vezes ao dia) e poucos efeitos colaterais, levando em consideração a maior atividade antimicrobiana do sistema G4 e os poucos efeitos colaterais do sistema G3.

As limitações deste estudo incluem o pequeno tamanho da amostra e a vermelhidão encontrada, que pode denotar irritação, em todos os grupos tratados. No entanto, deve-se considerar que ardor, coceira, irritação e vermelhidão nos olhos são efeitos colaterais comuns após a instilação de NFX.

NPs de PLGA carregados com NFX foram desenvolvidos com sucesso usando a técnica de emulsão dupla / evaporação de solvente. Com base na análise de planejamento fatorial e estimativa dos índices de desejabilidade, duas fórmulas (NP2 e NP6) foram selecionadas por possuírem alta magnitude de ZP, EE%, Q12h e P12h, bem como baixo PS, Q30min e P30min. Hidrogéis à base de HPMC carregados com NFX carregados com NFX límpidos, propagáveis, toleráveis ​​e tixotrópicos foram desenvolvidos com sucesso. Os sistemas G3 e G4 podem ser considerados sistemas de liberação ocular adequados para NFX, no que diz respeito a perfis de permeação prolongada de drogas, atividades antimicrobianas razoáveis ​​contra Pseudomonas aeruginosa e perfis de segurança promissores. Mais estudos clínicos são necessários para confirmar o potencial desses sistemas.

Os autores não relatam conflitos de interesse para este trabalho.

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