O antagonista do receptor sigma-1 seletivo E-52862 atenua a dor neuropática de diferentes etiologias em ratos | Relatórios Científicos

2021-11-18 11:56:15 By : Sea Xu

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Scientific Reports volume 6, Article number: 24591 (2016) Citar este artigo

E-52862 é um antagonista σ1R seletivo atualmente em ensaios clínicos de fase II para dor neuropática e representa um potencial analgésico de primeira classe. Aqui, investigamos o efeito da administração única e repetida de E-52862 em diferentes comportamentos relacionados à dor em vários modelos de dor neuropática em ratos: alodinia mecânica em dor neuropática cefálica (trigêmeo) após lesão de constrição crônica do nervo infraorbital (IoN), hiperalgesia mecânica na polineuropatia diabética induzida por estreptozotocina (STZ) e alodinia fria na polineuropatia induzida por oxaliplatina (OX). A hipersensibilidade mecânica induzida após cirurgia IoN ou administração de STZ foi reduzida pelo tratamento agudo com E-52862 e morfina, mas não por pregabalina. No modelo OX, a administração única de E-52862 reverteu a hipersensibilidade a estímulos frios de maneira semelhante a 100 mg / kg de gabapentina. Curiosamente, a administração repetida de E-52862 duas vezes ao dia durante 7 dias não induziu tolerância farmacodinâmica, mas um aumento do efeito antinociceptivo em todos os três modelos. Além disso, conforme mostrado nos modelos STZ e OX, o tratamento diário repetido com E-52862 atenuou os comportamentos iniciais de dor, o que oferece suporte a um efeito modificador modificado nos mecanismos subjacentes de geração de dor. Esses achados pré-clínicos apoiam um papel para σ1R na dor neuropática e estendem o potencial para o uso de antagonistas σ1R seletivos (por exemplo, E-52862) para o tratamento crônico de dor neuropática cefálica e extra-cefálica.

A dor neuropática é desencadeada por dor espontânea contínua ou aguda e respostas de dor amplificada evocadas após estímulos nocivos ou não nocivos1. A terapia atual para dor neuropática não é para alguém e, portanto, novos fármacos que atuam em novos alvos moleculares são investigados2,3. Surgiram várias abordagens terapêuticas visando diferentes proteínas modulatórias. Dentre eles, o receptor sigma-1 (σ1R) tem sido descrito como tendo um papel no controle da dor4. σ1R é uma proteína chaperona intracelular que interage com outras proteínas, incluindo a membrana plasmática e os receptores do retículo endoplasmático e canais iônicos. No contexto da dor, o σ1R modula os fenômenos de sensibilização central5,6, que são responsáveis ​​por muitas das mudanças temporais, espaciais e de limiar na sensibilidade à dor na dor aguda e crônica7. Consequentemente, o tratamento farmacológico com antagonistas de σ1R em camundongos do tipo selvagem (WT) exerceu efeitos antinociceptivos e camundongos nocaute de σ1R (KO) mostraram um fenótipo de redução da dor em diferentes modelos experimentais de dor6,8,9,10,11,12,13,14 .15.

O perfil farmacológico in vitro e in vivo do antagonista σ1R E-52862 (S1RA) foi descrito6. E-52862 mostra alta afinidade e seletividade σ1R. Ele se liga a σ1R no SNC quando administrado sistemicamente, conforme mostrado por ensaios de ligação autorradiográfica ex vivo em camundongos e sua eficácia se correlaciona com a ocupação de σ1Rs. Mostra um bom perfil pré-clínico de segurança e eficácia em camundongos6. Especificamente, alodinia mecânica induzida por formalina6, alodinia mecânica induzida por capsaicina6, alodinia mecânica e fria induzida por paclitaxel15, hipersensibilidade mecânica e térmica induzida por lesão de nervo6 e hipersensibilidade mecânica e térmica induzida por inflamação13,14 foram inibidos de forma dependente da dose pela administração sistêmica aguda de E -52862.

E-52862 completou estudos clínicos de fase I de dose única e múltipla demonstrando boa segurança, tolerabilidade e perfis farmacocinéticos em humanos16 e está atualmente em ensaios clínicos de fase II para o tratamento de dor neuropática de etiologia diferente, usando uma dose oral diária de 400 mg. No presente estudo, testamos a eficácia do E-52862 em três modelos de ratos de dor neuropática de diferentes etiologias: dor neuropática trigeminal após lesão de constrição crônica do nervo infraorbital (IoN) 17, neuropatia diabética induzida por estreptozotocina (STZ) 18 e oxaliplatina Neuropatia dolorosa induzida por (OX) 19. Esses modelos de dor neuropática simulam condições clínicas de dor com diversas etiologias, como neuralgia do trigêmeo20, polineuropatia dolorosa diabética21 e dor neuropática induzida por quimioterapia22. A dor neuropática é um tipo de dor persistente (crónica) que, na prática clínica, frequentemente requer tratamentos farmacológicos de longo prazo. E-52862 foi administrado repetidamente a ratos neuropáticos durante vários dias e os seus efeitos analgésicos crónicos foram comparados com os efeitos agudos.

Os valores basais foram obtidos um dia antes da cirurgia, estabelecendo a resposta normal aos filamentos de von Frey (fig. 1A). A constrição crônica do IoN induziu mudanças significativas em resposta à estimulação mecânica do território inervado pelo IoN ipsilateral ligado (Fig. 1B). Inicialmente, 5 dias após a cirurgia, a pontuação de resposta caiu significativamente, indicando hiposensibilidade, mas isso foi seguido por uma hipersensibilidade robusta à estimulação do filamento de von Frey nos dias 15 e 25 após a cirurgia de IoN e a hipersensibilidade foi mantida pelo menos por 32 dias após a constrição de IoN ( F4,233 = 533,7, p <0,001, ANOVA; p <0,001 para os dias 5, 15, 25 e 32 vs. linha de base).

Modelo de dor neuropática do trigêmeo na lesão de constrição crônica do IoN.

(A) Protocolo experimental. Os efeitos agudos do tratamento das drogas foram avaliados no dia 25 após a cirurgia IoN. A administração repetida dos medicamentos foi avaliada no dia 32 após 7 dias de administração diária repetida. (B) Curso relacionado ao tempo de alodinia mecânica após a conexão IoN. A avaliação foi realizada um dia antes da cirurgia (linha de base) e nos dias 5, 15 e 25 de pós-operatório (círculos pretos). (C) Efeito de uma única administração ip de E-52862 (20 e 40 mg / kg, ip; barras cinza), morfina (5 mg / kg; barras tracejadas diagonais) e pregabalina (40 mg / kg; barras tracejadas horizontais) em alodinia mecânica. (D) Efeito da administração ip repetida de E-52862 (20 e 40 mg / kg; barras cinza) e morfina (5 mg / kg; barras diagonais tracejadas) na alodinia mecânica. Cada ponto e linha vertical representam a média ± SEM dos valores obtidos em pelo menos 10 ratos por tratamento e grupos de linha de base. *** p <0,001 vs. pré-cirurgia em (B). ** p <0,01; *** p <0,001 vs. grupo de veículo em (C) e (D) (ANOVA de uma via seguida de teste de Newman-Keuls).

Os medicamentos foram administrados quando a alodinia mecânica estava totalmente desenvolvida, no dia 25 pós-cirurgia. A administração ip única de E-52862 inibiu significativamente a alodinia mecânica a 40 mg / kg, mas não a 20 mg / kg. Da mesma forma, a morfina (5 mg / kg) exerceu um efeito antialodínico (F5,124 = 8,5, p <0,001, ANOVA; p <0,01 para E-52862 40 mg / kg vs. veículo; p <0,001 para morfina 5 mg / kg vs. veículo), mas pregabalina (40 mg / kg) foi ineficaz (Fig. 1C).

Para avaliar o efeito de administrações repetidas, E-52862 e morfina foram oferecidos por 7 dias (do dia 25 ao dia 32 após a cirurgia) (Fig. 1A). Após 7 dias de administração, E-52862 exerceu efeito antinociceptivo (antialodínico; redução do escore de resposta) a 20 e 40 mg / kg. Em contraste, a morfina (5 mg / kg) desenvolveu tolerância, pois era desprovida de efeitos antinociceptivos quando testada após administração repetida por 7 dias (F3,49 = 17,4, p <0,001, ANOVA; p <0,001 ep <0,01 para E -52862 40 e 20 mg / kg, respectivamente, vs. veículo).

Os ratos mostraram níveis aumentados de glicose 4 dias após a injeção de STZ (453,3 ± 9,0 mg / dl vs. 115,7 ± 1,8 mg / dl, p <0,001; Fig. 2B) hiperalgesia mecânica) por 3-4 semanas após a injeção de STZ (de 418,9 ± 5,4 a 220 ± 5,6 gramas, F2,162 = 354,4, p <0,001, ANOVA; p <0,001 para os dias 21 e 28 pós-STZ vs. linha de base) (Fig. 2B).

Modelo de dor neuropática diabética após injeção de STZ.

(A) Protocolo experimental. Os efeitos agudos do tratamento das drogas foram avaliados no dia 21 após a injeção de STZ. As administrações repetidas dos medicamentos foram avaliadas no dia 28 após 7 dias de administração diária. (B) Curso relacionado ao tempo de hiperalgesia mecânica após a injeção de STZ (triângulos pretos) e os níveis de glicose no sangue (barras brancas) avaliados 4 dias após a injeção de STZ. (C) Efeitos de uma única administração ip de E-52862 (40 e 80 mg / kg; barras cinza e pretas), morfina (10 e 20 mg / kg; barras diagonais) e pregabalina (80 mg / kg; barras horizontais barras) na hiperalgesia mecânica. (D) Efeito da administração ip repetida de E-52862 (40 mg / kg; barras cinza) na hiperalgesia mecânica. Os ratos foram avaliados antes e 15 minutos após a última administração. Cada ponto e linha vertical representa a média ± SEM dos valores obtidos de pelo menos 8 animais por grupo de tratamento. Diferença entre pré e pós-STZ nos níveis de glicose e hiperalgesia mecânica: *** p <0,001 (teste t de Student para valores de glicose e ANOVA de uma via seguido de teste de Newman-Keuls para desenvolvimento de hiperalgesia); *** p <0,001 vs. grupo de veículo (HPMC 0,5%) (ANOVA de uma via seguida de teste de Newman-Keuls).

A administração sistêmica aguda de 80 mg / kg —mas não 40 mg / kg— de E-52862 diminuiu significativamente a hipersensibilidade mecânica em ratos tratados com STZ em 44% (F6,122 = 20,9, p <0,001, ANOVA; p <0,001 para E -52862 80 mg / kg vs. veículo; Fig. 2C). A morfina a 20 mg / kg reverteu a hipersensibilidade mecânica em ratos diabéticos. Em contraste, a morfina a 10 mg / kg e a pregabalina a 80 mg / kg não mostraram qualquer efeito significativo (Fig. 2C).

O efeito da dose repetida bid por 7 dias consecutivos (do dia 21 ao dia 27 após a injeção de STZ) com 40 mg / kg de E-52862 (dose cumulativa por dia de 80 mg / kg) na hipersensibilidade mecânica desenvolvida em pacientes tratados com STZ ratos foram avaliados (Fig. 2D). Como esperado, a administração de STZ induziu hiperalgesia à estimulação mecânica das patas traseiras (F7,112 = 37,4, p <0,001, ANOVA; p <0,001 para linha de base vs. dia 21). No dia 28, no dia após a conclusão do período de tratamento de 7 dias (16 horas após a última administração de E-52862) e antes do tratamento (pré-dose), a hipersensibilidade mecânica diminuiu em ratos tratados com STZ que receberam E-52862 ( de 237,8 ± 10,5 g em ratos tratados com HPMC a 311,7 ± 30,8 g em ratos tratados com E-52862). A administração de uma dose adicional de 40 mg / kg de E-52862 no dia 28 (pós-dose) falhou em alterar significativamente o limiar mecânico em relação ao valor pré-dose (a hiperalgesia foi reduzida em comparação com o tratamento com veículo de 7 dias ratos e semelhante à pré-dose, mas a dosagem adicional não foi capaz de reduzir ainda mais a hiperalgesia) (F7,112 = 37,4, p <0,001, ANOVA; p <0,001 para E-52862 40 mg / kg vs. HPMC em ambos pré- e avaliações pós-dose no dia 28).

A administração de X (Fig. 3A) induziu alodinia ao frio, isto é, aumento da pontuação cumulativa ao frio no teste de acetona em relação aos animais tratados com HPMC (veículo) nos dias 8, 15 e 16 (F3.36 = 10.1, p <0,001 para o pontuação cumulativa de frio; Fig. 3B).

Dor neuropática induzida por quimioterapia após tratamento com OX.

(A) Protocolo experimental. Os efeitos agudos do tratamento das drogas foram avaliados no dia 8 após quatro administrações de OX. A administração repetida de medicamentos foi avaliada no dia 15 após 7 dias de administração diária. As pontuações cumulativas do frio em resposta à acetona foram avaliadas nos dias 8, 15 e 16 após a leitura da linha de base (dias de teste). (B) Curso relacionado ao tempo de alodinia ao frio após o tratamento com OX avaliado como pontuação cumulativa ao frio. (C) Efeitos de uma única administração ip de E-52862 (barras cinza e pretas) e gabapentina (barras diagonais tracejadas) a 40 e 100 mg / kg, respectivamente, na alodinia fria. (D) Efeitos dose-resposta da administração repetida de E-52862 (20, 40 e 80 mg / kg) e resposta ao estímulo frio um dia após a última administração (dia 16). Cada ponto e linha vertical representam a média ± SEM dos valores obtidos de 10 animais por grupo. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 vs. cada grupo de veículo (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Newman-Keuls).

A alodinia ao frio relacionada à neuropatia já era estatisticamente significativa em comparação com o grupo não neuropático no dia 8 após o início da administração de OX (1,1 ± 0,4 vs. 5,0 ± 0,8, respectivamente; p <0,01 ep <0,001; Fig. 3B). Nas experiências de tratamento agudo (dia 8), E-52862 exerceu um efeito antialodínico dependente da dose na pontuação cumulativa de frio (Fig. 3C). A menor dose testada (20 mg / kg) não reduziu significativamente a alodinia ao frio, mas E-52862 exerceu um efeito antinociceptivo significativo quando administrado a 40 mg / kg (F5,54 = 10,2, p <0,001, ANOVA; p <0,05 para E -52862 40 mg / kg vs. veículo) e reverteu a alodinia ao frio de volta aos valores basais normais de até 80 mg / kg. Como analgésico padrão, o efeito agudo da gabapentina também foi avaliado. A gabapentina administrada por via oral a 100 mg / kg no dia 8 reverteu a alodinia ao frio induzida por OX, conforme evidenciado por uma pontuação cumulativa significativamente diminuída no teste de acetona.

Para avaliar o efeito da administração repetida, E-52862 foi dosado do dia 8 ao 15 (Fig. 3A). No dia 15 (último dia de administração), a alodinia ao frio foi significativamente inibida por E-52862 em todas as três doses (20, 40 e 80 mg / kg) e de uma forma dependente da dose (F4,45 = 8,5, p <0,001 , ANOVA; p <0,001, p <0,01 ep <0,05 para E-52862 a 80, 40 e 20 mg / kg, respectivamente, vs. veículo; Fig. 3D). Curiosamente, a redução da alodinia ao frio ainda era perceptível após a conclusão do tratamento no dia 16, 24 h após a última administração (F4,45 = 8,0, p <0,001, ANOVA; p <0,01 para E-52862 a 40 e 80 mg / kg vs. veículo ; Fig. 3D).

Ao contrário de outras condições de dor neuropática, a administração de quimioterapia a pacientes com câncer é um procedimento planejado / programado e, portanto, a dor neuropática pode ser esperada (e antecipada) em um período de curto prazo após a administração do citostático. Assim, faz sentido, neste caso, investigar abordagens preventivas que possam atenuar esse efeito indesejável dos antineoplásicos.

Portanto, dado o benefício potencial de co-administrar pacientes com drogas antineoplásicas e drogas que neutralizam os efeitos indesejáveis ​​dos antineoplásicos, o possível efeito preventivo do E-52862 no desenvolvimento de dor neuropática induzida por OX (isto é, alodinia ao frio) também foi investigado. Para este propósito, E-52862 foi administrado ipbid a 40 mg / kg começando 2 dias antes da primeira injeção de OX e durante todo o período de tratamento de OX (última injeção de OX no dia 14) (Fig. 4A). No dia 8, os ratos co-tratados com OX e E-52862 bid a 40 mg / kg exibiram pontuações de frio cumulativas significativamente mais baixas em comparação com o grupo de veículo OX (p <0,01 para comparações entre E-52862 40 mg / kg vs. veículo ; Fig. 4B). Uma semana depois, no dia 15, o efeito antialodínico do tratamento foi mantido (F2,25 = 13,5, p <0,001, ANOVA; p <0,01 E-52862 40 mg / kg vs. veículo). Curiosamente, 24 horas após a conclusão do tratamento com E-52862 (dia 16), os animais mostraram redução da alodinia ao frio (F2,25 = 16,4, p <0,001, ANOVA; p <0,01 E-52862 40 mg / kg vs. veículo) em comparação com o veículo -tratado grupo tratado com OX (3,5 ± 0,7 vs. 6,7 ± 0,9), embora os escores cumulativos de dor fossem maiores do que os valores basais em animais não neuropáticos que não receberam OX (F2,25 = 16,4, p <0,001, ANOVA ; p <0,05 para comparações entre E-52862 (40 mg / kg vs. linha de base).

Efeito da administração repetida de E-52862 na alodinia ao frio em um paradigma preventivo na neuropatia induzida por OX em ratos.

(A) Protocolo preventivo experimental. Nesse caso, a administração de E-52862 foi iniciada dois dias antes da primeira injeção de OX. O efeito preventivo foi avaliado nos dias 8, 15 e 16 após a primeira injeção de OX (dias de teste). A avaliação no dia 16 foi realizada um dia após a última administração de E-52862. (B) Efeitos da administração repetida de E-52862 a 40 mg / kg (barras cinza) no protocolo preventivo na alodinia ao frio avaliada como pontuação cumulativa ao frio. Cada ponto e linha vertical representam a média ± SEM dos valores obtidos de 10 animais por grupo. ** p <0,01; *** p <0,001 vs. grupo de veículo (ANOVA de uma via seguida de teste de Newman-Keuls).

Um papel bastante convincente de σ1R na dor foi proposto a partir de estudos pré-clínicos em modelos de diferentes tipos de dor, mas a maioria dos estudos usou ratos como sujeitos experimentais, cirurgia de nervo periférico como modelo experimental de neuropatia e abordagens de tratamento agudo. No presente estudo, esses achados foram ampliados pelo uso de ratos em três modelos diferentes de dor neuropática com valor translacional para medir os processos de dor relacionados à doença de etiologia diversa e grande necessidade não atendida de tratamento. Nesse sentido, a neuralgia do trigêmeo20, a polineuropatia dolorosa diabética21 e a dor neuropática induzida por quimioterapia22 são condições clínicas importantes de dor, muitas vezes refratárias às farmacoterapias atuais. Não apenas o tratamento único (agudo), mas também repetido (subcrônico / crônico) com E-528626, um antagonista σ1R seletivo, foi investigado para descobrir se o bloqueio farmacológico sustentado de σ1R induz tolerâncias e se administrações repetidas poderiam interferir na expressão da dor neuropática . Diferentes leituras mecânicas e térmicas evocadas foram medidas para monitorar o desenvolvimento da dor e o efeito antinociceptivo dos tratamentos com drogas. As principais conclusões foram que o E-52862 exerceu efeitos antinociceptivos nos diferentes modelos de dor neuropática em ratos e que os seus efeitos não só se mantiveram como aumentaram após administração repetida. Os dados presentes estendem a evidência recente de que o antagonismo de σ1R constitui um novo mecanismo de analgesia, cujo espectro também pode abranger um tratamento crônico de dor neuropática cefálica (trigêmeo) e extra-cefálica.

A maioria dos modelos de dor neuropática são, na verdade, modelos de dor neuropática extra-cefálica, pois dependem da lesão dos nervos espinhais com retransmissão primária envolvendo neurônios nos gânglios da raiz dorsal e no corno dorsal da medula espinhal. Ao contrário da dor extra-cefálica, a dor neuropática cefálica afeta os territórios dos nervos cranianos e envolve a retransmissão sináptica primária pelos neurônios nos gânglios cefálicos e núcleos do tronco cerebral. Não apenas a anatomia, mas também a fisiopatologia e a resposta aos analgésicos diferem quando comparamos a dor neuropática extra-cefálica e a cefálica, tanto pré-clínica quanto clinicamente23,24,25,26. O modelo de rato de lesão de constrição crônica do quinto nervo craniano (nervo infraorbital; IoN) foi relatado como um modelo para dor neuropática cefálica (trigêmeo) (ou seja, neuralgia do trigêmeo) em humanos25,26,27. Conforme mostrado em estudos anteriores17,28, descobrimos que os comportamentos nociceptivos após lesão IoN foram caracterizados por uma robusta hipersensibilidade mecânica precedida por uma fase transitória de menor responsividade à estimulação mecânica do território IoN. A administração aguda de morfina e E-52862 —mas não pregabalina— reverteu a alodinia mecânica observada neste modelo de dor. O efeito antinociceptivo agudo da morfina e a falta de eficácia da gabapentina (outro gabapentinoide semelhante à pregabalina) foram relatados anteriormente29,30. O efeito antinociceptivo de E-52862 foi a primeira evidência de eficácia com um ligante σ1R neste modelo de dor cefálica, onde gabapentinoides - que atuam em modelos de dor neuropática extra-cefálica - são ineficazes, mas medicamentos antimigranosos, como triptanos (sumatriptano e zolmitriptano), diidroergotamina e olcegepant — que são essencialmente inativos na dor extra-cefálica— são eficazes23,26. A eficácia de E-52862 no modelo IoN está de acordo com alguma literatura recente que mostra efeitos inibitórios do antagonista σ1R BD1047 na ativação nociceptiva do núcleo caudal do trigêmeo no modelo de cefaléia induzida por capsaicina em ratos31 e as respostas nociceptivas comportamentais em o modelo de formalina orofacial em camundongos32. Por sua vez, a ativação de σ1R por administração intracisternal do agonista σ1R PRE084 evocou a ativação nociceptiva do núcleo caudal do trigêmeo em ratos, que o antagonista BD1047 reverteu33. Finalmente, é importante notar que a administração do antagonista σ1R E-52862 por 7 dias não induziu tolerância antinociceptiva em um protocolo onde a tolerância ao efeito antinociceptivo da morfina foi claramente observada. Pelo contrário, o efeito foi aumentado quando precedido por administrações anteriores, a eficácia após administração repetida foi significativa a 20 mg / kg (a dose mais baixa utilizada), a dose que foi insuficiente para provocar efeitos antialodínicos significativos após administração aguda única.

Em relação à dor neuropática extra-cefálica, a neuropatia diabética está entre as complicações de longo prazo mais frequentes do diabetes mellitus e os tratamentos atuais são apenas parcialmente eficazes. O modelo STZ em ratos foi selecionado por ser o modelo mais amplamente utilizado para o estudo da polineuropatia dolorosa diabética em roedores, onde muitos analgésicos padrão foram testados34,35,36. De acordo com relatórios anteriores 36,37, ratos injetados com esta toxina para células β pancreáticas exibiram aumento significativo de glicose plasmática e ingestão de água, diminuição do peso corporal e aumento da sensibilidade a estímulos de pressão nociva (ou seja, hiperalgesia mecânica) em comparação com o controle, não ratos diabéticos, reproduzindo assim os sintomas observados em humanos diabéticos38,39. Além do E-52862, dois medicamentos comercializados (morfina e pregabalina) com um mecanismo de ação diferente foram usados ​​para tratar a hipersensibilidade mecânica de ratos tratados com STZ. A administração única de morfina a 10 mg / kg (em uma dose bastante alta) não produziu nenhum efeito significativo, mas a morfina reverteu a hiperalgesia mecânica quando administrada a 20 mg / kg (em uma dose muito alta). Esse resultado se soma à evidência de que a sensibilidade ao efeito analgésico da morfina é baixa em animais diabéticos40,41 e está de acordo com relatos clínicos de que a morfina não tem eficácia no alívio sintomático da dor neuropática em pacientes diabéticos42,43. Da mesma forma, a administração de uma dose bastante elevada de pregabalina (80 mg / kg) foi ineficaz em nosso modelo. Nesse sentido, a pregabalina demonstrou fornecer algum grau de alívio da dor em pacientes com neuropatia diabética dolorosa44 e outros estudos relataram efeitos antinociceptivos significativos dessa droga em ratos diabéticos induzidos por STZ; no entanto, esse efeito foi modesto quando a hiperalgesia mecânica foi avaliada45. A administração única de E-52862 reduziu significativamente a hipersensibilidade mecânica em ratos tratados com STZ com uma dose de 80 mg / kg, mas não com 40 mg / kg. Este é o primeiro relato da eficácia de uma ligação σ1R em um modelo de neuropatia diabética e, portanto, não pode ser discutido contra os achados em outros estudos, mas é consistente com os efeitos anti-hiperalgésicos exercidos por E-52862 e outros antagonistas σ1R4,6,13 , 46 e o ​​fenótipo "resistente à dor" de camundongos σ1R KO em um espectro de condições de dor9,11,12,15. Apenas para notar que a hiperalgesia mecânica induzida por STZ parece ser difícil de tratar a condição de dor, pelo menos em nossas mãos, com base na falta de eficácia / potência reduzida dos medicamentos comercializados e na atividade do E-52862, menor do que em outros modelos / readouts, incluindo o modelo IoN descrito anteriormente. Curiosamente, a dose de 40 mg / kg, que não produziu qualquer efeito significativo no tratamento agudo, foi eficaz contra a hipersensibilidade mecânica em ratos diabéticos quando precedida por administração repetida de E-52862 40 mg / kg duas vezes ao dia por 7 dias consecutivos. Na verdade, a hiperalgesia foi atenuada já antes da última administração (injeção anterior de 40 mg / kg de E-52862 no dia anterior), o que apóia não apenas a falta de tolerância, mas sugere um efeito modificador na dor basal subjacente (ou, alternativamente, acúmulo de droga , o discutido mais tarde).

Um terceiro modelo, o modelo de neuropatia induzida por OX em ratos, foi usado para mimetizar a dor neuropática observada em pacientes com câncer recebendo este agente quimioterápico19,47. X é um antineoplásico de terceira geração à base de platina, utilizado no tratamento do câncer colorretal que induz neuropatia dolorosa marcada por acentuada sensibilidade ao frio19,48. Consistente com os sintomas clínicos, os ratos tratados com OX mostraram alodinia ao frio já no dia 8 após o início do tratamento com OX. Outros autores, usando vários modelos de roedores de neuropatia induzida por quimioterapia, encontraram resultados semelhantes49,50. A administração oral única de 100 mg / kg de gabapentina no dia 8 reduziu esse comportamento relacionado à dor, o que está de acordo com achados anteriores no mesmo modelo de dor neuropática19,50,51. A gabapentina é uma droga conhecida com o mesmo mecanismo de ação da pregabalina. Ambos são derivados de aminoácidos do ácido gama-amino butírico (análogo de GABA) e têm perfil farmacológico semelhante52. Em relação à modulação σ1R, E-52862 reduziu a alodinia ao frio. O efeito da administração aguda de E-52862 no dia 8 foi dependente da dose e equivalente em eficácia à gabapentina. Novamente, este é o primeiro estudo que descreve a eficácia de um ligante σ1R neste modelo, mas, neste caso, nossos dados são suportados por descobertas em um modelo e espécies diferentes de quimioterapia, o modelo de dor neuropática induzida por paclitaxel em camundongos. A alodinia mecânica e fria induzida por paclitaxel foi revertida de forma dose-dependente por E-52862 e BD1063, outro antagonista σ1R, e não se desenvolveu em camundongos σ1R KO, o que reforça os dados farmacológicos com os antagonistas15,53. Desta forma, é importante notar que os medicamentos antineoplásicos produzem uma neuropatia periférica dolorosa caracterizada por alterações mitocondriais nos nervos periféricos, que o tratamento profilático de camundongos com BD1063 não só evitou a alodinia induzida por paclitaxel, mas também o tratamento mitocondrial e que o tratamento com paclitaxel não induziu anormalidades mitocondriais em camundongos σ1R KO53. Além disso, nos dois modelos anteriores, na tolerância, mas atividade aumentada em relação ao tratamento agudo foi encontrada após a administração repetida de E-52862 no modelo OX (por exemplo, a dose de 20 mg / kg, ineficaz após tratamento único, exerceu efeito antialodínico significativo no dia 15, o último dia de tratamento, quando precedido por administração repetida de E-52862 por 7 dias consecutivos). Além disso, semelhante aos achados no modelo STZ, o comportamento relacionado à dor foi atenuado no modelo OX um dia após a última administração de E-52862 (dia 16; washout de 24 horas, na ausência de tratamento ativo), tanto quando administrado a partir de dia 8 por 7 dias consecutivos e quando coadministrado com OX ao longo do período de tratamento OX (E-52862 injetar ipbid a 40 mg / kg começando 2 dias antes da primeira injeção de OX e até a última injeção de OX no dia 15), que mais uma vez, sugere um efeito modificador na dor basal subjacente (ou, alternativamente, o acúmulo de drogas, conforme discutido abaixo).

Os tratamentos repetidos com E-52862 resultaram em maior eficácia e potência em relação aos tratamentos únicos / agudos em todos os três modelos de dor neuropática. Ou seja, maior atividade antinociceptiva e doses mais baixas eram necessárias para reduzir os diferentes comportamentos relacionados à dor se a administração do dia do teste fosse precedida por administrações diárias repetidas de E-52862 (7 dias, bid). Isso descarta os fenômenos de tolerância farmacodinâmica, mas abre a possibilidade de que tratamentos repetidos possam exercer um efeito modificador na dor inicial (ou seja, um efeito farmacodinâmico sustentado nos limiares nociceptivos ao longo do tempo devido à ação contínua do composto que resulta em uma atenuação progressiva da dor). A observação de que os comportamentos relacionados à dor foram reduzidos no dia após a conclusão do tratamento repetido em animais tratados com veículo em relação ao E-52862 apóia a possibilidade de um efeito farmacodinâmico sustentado. Alternativamente, os efeitos antinociceptivos aumentados após a administração repetida podem ser explicados por um efeito farmacocinético devido ao acúmulo da droga ao longo do tempo. No entanto, isso é altamente improvável devido ao perfil farmacocinético de E-52862 em roedores. A concentração plasmática máxima é alcançada logo após sua administração a roedores (tmax = 15 min após a administração ip a camundongos e ratos) e é rapidamente metabolizada, tendo uma meia-vida curta (t1 / 2 = 1,4 h após a administração a camundongos e ratos) . Níveis plasmáticos indetectáveis ​​foram encontrados 6 horas após sua administração, seus metabólitos são inativos e não se acumulam nos tecidos, incluindo o cérebro e a medula espinhal6. Em conjunto, a farmacodinâmica, mas não a farmacocinética (ou seja, o acúmulo de drogas), pode explicar o aumento do efeito antinociceptivo após a administração repetida de E-52862 e também a hiperalgesia e alodinia atenuadas encontradas sem a administração de E-52862 no dia após a conclusão do tratamento. Curiosamente, está de acordo com o mecanismo de ação de σ1R e o efeito inibitório atribuído ao antagonismo de σ1R sobre fenômenos de sensibilização central, conforme relatado em nível comportamental, eletrofisiológico e molecular. Comportamentalmente, sabe-se que a) hipersensibilidade mecânica secundária induzida por capsaicina (por exemplo, alodinia) resulta da sensibilização central (ou seja, alterações plásticas na medula espinhal devido às descargas nociceptivas intensas iniciais que seguem a injeção de capsaicina e resultam em subsequente sensibilidade à dor ), que b) os antagonistas de σ1R bloqueiam a alodinia mecânica induzida por capsaicina6,10,11; e que c) a capsaicina não induz alodinia mecânica quando injetada em camundongos σ1R KO11. Eletrofisiologicamente, sabe-se que a estimulação repetitiva da raiz dorsal em intensidades de estímulo ativando as fibras C produz uma amplificação típica dos sinais nociceptivos na medula espinhal (resposta de wind-up). Wind-up é o resultado da sensibilização dos neurônios do corno dorsal espinhal, cuja excitabilidade aumentada é evocada pela estimulação repetitiva das fibras C aferentes e representa uma amplificação espinhal da mensagem vinda dos nociceptores periféricos54,55,56. Antagonistas σ1R (ou seja, E-52862) inibem de forma dependente da dose o fenômeno de enrolamento espinhal quando os trens de fibras aferentes nociceptivas foram aplicados6,57 e, consequentemente, a amplificação do enrolamento espinhal dos sinais nociceptivos é altamente reduzida na medula espinhal de σ1R Ratinhos KO12. Finalmente, em nível molecular, o aumento da sinalização por meio do receptor NMDA glutamatérgico nos neurônios do corno dorsal é conhecido por ser um mediador-chave do enrolamento espinhal56,58 e responsável pela sensibilização e hipersensibilidade à dor7. O próprio receptor NMDA torna-se fosforilado nos neurônios do corno dorsal após estimulação nociva ou lesão nervosa e isso facilita as respostas NMDA e, portanto, a sensibilização central e a hipersensibilidade à dor. Ligantes de σ1R são reguladores pós-sinápticos da transmissão sináptica mediada por receptor NMDA. A ativação de σ1R aumenta o aumento mediado pelo receptor NMDA na concentração de Ca2 citosólico e nas correntes59,60. Em contraste, as respostas mediadas pelo receptor NMDA são inibidas e os efeitos de aumento dos agonistas σ1R nos receptores NMDA são bloqueados pela antagonização do σ1R59,61. Consequentemente, a ativação do σ1R espinhal por administração intratecal do agonista σ1R PRE084 evocou dor concomitante com o aumento da fosforilação da subunidade NR1 do receptor NMDA e ambos os comportamentos nociceptivos e aumento da fosforilação de NR1 na medula espinhal foram inibidos pelo antagonismo da medula espinhal σ1R com BD104762. 63 64. Do ponto de vista mecanicista, sabemos agora que σ1R interage com a subunidade NR1 dos receptores NMDA e que os antagonistas σ1R (E-52862) remove a ligação de σ1R às subunidades NR1, a entrada de reguladores negativos da atividade do receptor NMDA , provavelmente Ca2 / calmodulina, que resulta na redução da sinalização e amplificação da dor mediada pelo receptor NMDA dependente de glutamato65. No geral, a evidência apóia um papel para σ1R na modulação da nocicepção ao inibir a excitabilidade aumentada secundária ao impulso aferente sustentado como um mecanismo subjacente ao seu efeito modulador. A atenuação das alterações plásticas (sensibilização central) após lesão do nervo pode, portanto, estar subjacente ao efeito de modificação farmacodinâmica sustentado na hipersensibilidade à dor exercida pelo E-52862 após a sua administração repetida.

Em resumo, os achados pré-clínicos aqui apóiam um papel de σ1R na expressão e no desenvolvimento de dor neuropática e estendem o uso potencial de antagonistas σ1R (por exemplo, E-52862) para o tratamento crônico de neuropáticos cefálicos (trigêmeos) e extra-cefálicos dor, apoiando assim o progresso de novos estudos em populações humanas. Na verdade, os estudos clínicos de fase 2 com E-52862 (400 mg, dose oral diária) na dor neuropática de etiologia diferente (incluindo de origem diabética e quimioterapia) estão em andamento.

Foram utilizados ratos Sprague-Dawley machos adultos (experimentos IoN e OX) e ratos Wistar (experimentos STZ) pesando entre 150–250 g no início da fase experimental. Os animais foram fornecidos com comida e água ad libitum e mantidos em condições laboratoriais controladas com temperatura mantida a 21 ± 1 ° C e ciclos de luz de 12 horas (ciclo escuro / claro reverso em experimentos IoN, luzes acesas às 20 horas). Os experimentos foram realizados em uma sala experimental à prova de som e com ar regulado. Todos os procedimentos experimentais e zootécnicos foram conduzidos de acordo com os princípios éticos da IASP para a avaliação da dor em animais conscientes66 e do Parlamento Europeu e da Diretiva do Conselho de 22 de setembro de 2010 (2010/63 / UE) e foram aprovados pelo Animal Ethics Comitê da Universidade de Antuérpia (experimentos IoN), o Parque Científico de Barcelona (experimentos STZ) e as Facultés de Médecine et Phamacie da Universidade de Auvergne (experimentos OX).

A oxaliplatina (OX) foi fornecida por Shan Dong Boyuan Chemical, dissolvida em água destilada e administrada por via intraperitoneal (ip). A estreptozotocina (STZ) e a acetona foram fornecidas pela Sigma Aldrich. STZ foi dissolvido em solução salina 0,9% e administrado por via ip. Todos os analgésicos, exceto a gabapentina, foram administrados ip. A gabapentina foi fornecida pela Zhejiang Chiral Medicine Chemicals (China) e foi administrada em 100 mg / kg por via oral (po). O E-52862 foi sintetizado pelos Laboratórios Esteve (Espanha), a pregabalina pela Mercachem (Holanda) e a morfina foi fornecida pela Direcção-Geral de Farmácia e Medicamentos (Ministério da Saúde Espanhol; Madrid, Espanha). Os fármacos foram dissolvidos em solução salina, 0,5% de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC; Sigma Aldrich) ou carboximetilcelulose (CMC; Sigma Aldrich) conforme indicado. Todas as drogas foram administradas em um volume de 10 ml / kg, exceto nos experimentos IoN - volume usado de 5 ml / kg.

As doses usadas para E-52862 estavam na faixa de 20–80 mg / kg por via intraperitoneal, que é a via de administração comum para investigar o efeito antinociceptivo de E-52862 em modelos pré-clínicos6,13,67. Essas doses fornecem exposições (medidas como concentração máxima, Cmax) correspondentes às doses orais humanas de cerca de 100–400 mg, po, sendo 400 mg a dose selecionada nos atuais ensaios clínicos de Fase II16.

O tempo pré-tratamento para E-52862 para avaliar o efeito antinociceptivo foi de 15 ou 30 min com base nos estudos farmacocinéticos de E-52862, que revelou exposição máxima 15-30 minutos após sua administração em roedores.

Procedimento cirúrgico: a parte infraorbital do nervo foi exposta e ligada conforme descrito por Vos et al.17. Resumidamente, os ratos foram anestesiados com pentobarbital (Nembutal, 60 mg / ml) até 60 mg / kg, ip seguido por uma dose fixa de 0,1 mg / kg de atropina. A cabeça do rato foi fixada em uma estrutura estereotáxica e uma incisão mediana do couro cabeludo foi feita, expondo o crânio e o osso nasal. O IoN foi exposto por meio de procedimento cirúrgico semelhante ao descrito anteriormente68,69. A borda da órbita, formada pelos ossos maxilar, frontal, lacrimal e zigomático, foi dissecada e liberada. O conteúdo orbital foi suavemente desviado com uma haste de madeira com ponta de algodão, assim o IoN foi dissecado e liberado em sua extensão mais rostral na cavidade orbital. Duas ligaduras de categute crônicas (5-0, Ethicon; Johnson e Johnson, Bélgica) foram amarradas frouxamente em torno do IoN (2 mm de distância). Para obter o grau de constrição desejado, foi aplicado um critério proposto por Bennett e Xie70: as ligaduras reduziam o diâmetro do nervo em uma quantidade apenas perceptível e retardavam, mas não interrompiam a circulação pela vasculatura superficial. A incisão do couro cabeludo foi fechada com suturas de poliéster (4-0, Ethicon; Johnson e Johnson). Em ratos com operação simulada, o IoN foi exposto em um lado usando o mesmo procedimento, mas o IoN exposto não foi vinculado.

A responsividade à estimulação mecânica do território IoN foi medida usando uma série de cinco fios de cabelo de von Frey (Stoelting Co): 0,015 g, 0,127 g, 0,217 g, 0,745 ge 2150 g. Após uma habituação de 10 minutos, os diferentes fios de cabelo de von Frey foram aplicados a cada vez no lado ipsilateral do território IoN. Foi determinada uma pontuação média para os filamentos. Os dados basais foram obtidos um dia antes da cirurgia e nos dias 5, 15 e 25 de pós-operatório (fig. 1A). O sistema de pontuação descrito por Vos et al.17 foi utilizado para avaliar a reação dos ratos ao estímulo. A resposta de um animal foi analisada de acordo com diferentes categorias de resposta: 0: nenhuma resposta, 1: detecção, 2: reação de abstinência, 3: fuga / ataque e 4: tratamento facial assimétrico. As pontuações mais baixas indicaram uma resposta fraca à estimulação mecânica, enquanto as pontuações mais altas indicaram uma capacidade de resposta forte. Os ratos foram injetados ip duas vezes ao dia (bid) com compostos dissolvidos em 0,5% de CMC. O teste comportamental foi realizado 30 minutos após a injeção.

Desenvolvimento de diabetes: O diabetes foi induzido em ratos por meio de pancreatectomia química por uma única injeção ip de STZ (75 mg / kg de peso corporal) dissolvido em solução salina, enquanto os ratos controle receberam apenas solução salina34. Os níveis de glicose no sangue foram avaliados antes do teste comportamental. O sangue foi extraído da veia da cauda quatro dias após a administração do STZ para calcular os níveis de açúcar no sangue por meio de glicosímetro (Cholestech LDX). Após a indução do diabetes (níveis de açúcar no sangue acima de 240 mg / dl), o consumo de comida e água, o volume urinário e os níveis de glicose aumentaram em animais diabéticos versus animais normais.

O limiar de hiperalgesia mecânica foi quantificado pelo teste de Randall-Selitto71 por meio de um aparelho comercialmente disponível (Ugo Basile, Itália). A resposta ao aumento da pressão aplicada no dorso da pata traseira do animal foi medida. O limiar nociceptivo foi definido como a pressão, em gramas, na qual o rato retira a pata.

A sensibilidade mecânica de ratos virgens foi testada pela primeira vez antes dos tratamentos de STZ e novamente três semanas após a administração de STZ nas patas traseiras esquerda e direita, a fim de selecionar aqueles animais que apresentam um limiar mecânico nociceptivo inferior a 270 g. Os tratamentos farmacológicos foram iniciados 21 dias após a injeção de STZ, imediatamente após a determinação da linha de base, com veículo (0,5% HPMC), morfina (10 e 20 mg / kg), pregabalina (80 mg / kg) e E-52862 (40 e 80 mg / kg / kg) por via ip (Fig. 2A). A hiperalgesia mecânica foi avaliada 1 hora e 15 min após a administração dos compostos de referência e do E-52862, respectivamente. Para determinar os efeitos da dosagem repetida na hipersensibilidade desenvolvida por ratos tratados com STZ, grupos separados de ratos tratados com STZ foram administrados bid por 7 dias consecutivos (do dia 21-27) com 40 mg / kg de E-52862 (dose cumulativa por dia 80 mg / kg) ou seu solvente (0,5% HPMC). A sensibilidade mecânica após a administração repetida de 7 dias foi avaliada no dia 28 antes (efeito pré-dose; período de eliminação de aproximadamente 16 horas após a última administração no dia 27) e após a dosagem adicional no dia 28 (efeito pós-dose).

Aquisição de neuropatia: a neuropatia periférica foi induzida por injeções ip repetidas de OX (3 mg / kg, ip), uma inicial e, em seguida, 3 vezes por semana durante 2 semanas (7 injeções; dose cumulativa = 21 mg / kg, ip) 72 . Injeções de água destilada foram usadas para reproduzir a condição não neuropática em um grupo controle (linha de base) (Fig. 3A).

A alodinia ao frio foi avaliada pelo teste da acetona. Neste teste, a intensidade da retirada da pata traseira foi medida após a aplicação de uma gota de acetona na superfície plantar de ambas as patas traseiras usando uma pontuação. As respostas à acetona foram graduadas na seguinte escala de 4 pontos: 0 (sem resposta), 1 (retirada rápida, movimento da pata), 2 (retirada prolongada ou movimento acentuado da pata), 3 (movimento repetitivo da pata com lamber ou morder). A pontuação cumulativa de frio é definida como a soma das 6 pontuações para cada rato, a pontuação mínima sendo 0 (sem resposta a qualquer uma das 6 tentativas) e a pontuação máxima sendo 18 (sacudidelas repetitivas e lambidas ou mordidas das patas em cada um as seis tentativas). A alodinia ao frio foi punida medindo as respostas à acetona nos dias 8, 15 e 16.

A fim de avaliar o efeito do tratamento de E-52862 na expressão da dor neuropática induzida por OX (protocolo "curativo" uma vez que a dor foi desenvolvida) (Fig. 3A), o composto foi administrado ip (20, 40 e 80 mg / kg)) em um paradigma de dosagem repetida do dia 8 ao dia 15 e seu efeito na alodinia ao frio foi avaliado no dia 8 (primeiro dia de administração), dia 15 (último dia de administração) e após a conclusão do tratamento no dia 16. No teste dias 8 e 15, E-52862 e veículo (0,5% HPMC) foram administrados 30 min antes do teste. Gabapentina (100 mg / kg, po) foi usada como um composto de referência positivo. Os animais do grupo tratado com gabapentina foram administrados 120 min antes do teste no dia 8.

A fim de avaliar um possível efeito preventivo de E-52862 no desenvolvimento de dor neuropática induzida por OX (Fig. 4A), E-52862 foi coadministrado com OX. Para este propósito, E-52862 foi administrado repetidamente, bid a 40 mg / kg ip, começando 2 dias antes da primeira injeção de OX (3 mg / kg; ip) e durante todo o período de tratamento de OX (última injeção de OX no dia 15). No dia do tratamento com OX, os animais foram doseados com o composto E-52862 30 min antes da injeção de OX. O teste de acetona foi realizado nos dias 8, 15 e 16 (24 h após a última administração).

Todos os dados são apresentados como média ± SEM. Quando várias médias foram comparadas, todos os valores foram submetidos a uma análise de variância unilateral (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Newman-Keuls. Para avaliar o desenvolvimento de diabetes, a comparação entre os valores de glicose na linha de base e pós-STZ (dia 4) foi analisada usando o teste t de Student. O software GraphPad Prism (versão 5.0; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA) foi usado. Em todos os casos, o critério de significância estatística foi estabelecido com um valor de p menor que 0,05.

Como citar este artigo: Gris, G. et al. O antagonista seletivo do receptor sigma-1 E-52862 atenua a dor neuropática de diferentes etiologias em ratos. Sci. Rep. 6, 24591; doi: 10.1038 / srep24591 (2016).

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Departamento de Farmacologia, Descoberta de Medicamentos e Desenvolvimento Pré-clínico, ESTEVE, Barcelona, ​​Espanha

Georgia Gris, Enrique Portillo-Salido, Bertrand Aubel, José Miguel Vela, Manuel Merlos e Daniel Zamanillo

ANS Biotech, RIOM Cedex, França

Laboratório de Anestesiologia, Universidade de Antuérpia, Antuérpia, Bélgica

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GG, EP-S., MM, JMV e DZ projetaram o (s) experimento (s) e escreveram o texto do manuscrito principal. GG, BA, KD e YD conduziram o (s) experimento (s). Todos os autores analisaram os resultados e revisaram o manuscrito.

Sim, existe potencial interesse financeiro competitivo. Georgia Gris, Enrique Portillo-Salido, Bertrand Aubel, José Miguel Vela, Manuel Merlos e Daniel Zamanillo são funcionários da ESTEVE.

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Gris, G., Portillo-Salido, E., Aubel, B. et al. O antagonista seletivo do receptor sigma-1 E-52862 atenua a dor neuropática de diferentes etiologias em ratos. Sci Rep 6, 24.591 (2016). https://doi.org/10.1038/srep24591

DOI: https://doi.org/10.1038/srep24591

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Relatórios científicos (Sci Rep) ISSN 2045-2322 (online)